非诺贝特对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

[摘 要] 目的 探讨非诺贝特对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作

用及其机制?

方法 将

64只SD大鼠随机分为假手术组?缺血再灌注组?150 mg/kg 非诺贝特组及300 mg/kg 非诺贝

特组，每组各16只，术前30 min分别给予相应处理?采取体内结扎左前降支的方法建立心肌

缺血再灌注损伤模型，予酶联免疫吸附法检测大鼠心肌组织中NF-κB p65及IL-6水平，H·E

染色观察左心室前壁细胞病理形态学改变，并采用Tunel法检测心肌细胞凋亡率?

结果 假手术组大鼠心肌组织中NF-κB p65及IL-6水平?心肌细胞凋亡率

分别为（8.11±0.83）pg/mg?（182.67±0.19）pg/mg?（5.09±0.79）%，与其余四组大

鼠相比

均显著降低（P

及IL-6水平，心肌细胞凋亡率明显降低（P

个不同剂量组比较，差异有统计学意义（P

特组中NF-κB p65及IL-6含量水平差异有统计学意义（r1=0.93，r2=0.74，P

）?

结论 非诺贝特可通过负性调节NF-κB p65含量水平进而减少IL-6的释放

，抑制心肌细胞的凋亡，从而在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用?

[关键词] 非诺贝特；心肌缺血/再灌注；核转录因子-κB p65；白

介素-6；细胞凋亡

中图分类号：R54；R972

文献标识码：A 文章编号：1009-816X

（2013）06-0449-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816X.2013.06.08

Study of Protection and Mechanisms of Fenofibrate in Rats wit

h Myocardium Ischemia-reperfusion Injury.

XU Ping， ZHOU Yue， YU Zhi. Department of Gerontology

， Zhejiang Provincial People's Hospital， Zhejiang 310024， China

[Abstract] Objective To explore the protection of fenofibrate

in rats with myocardium ischemia-reperfusion injury and its mechanisms.

Methods 64 Sprague-Dawley

rats were randomly divided into four groups as sham-operation group， ischemia-re

perfusion group， 150 mg/kg fenofibrate group and 300 mg/kg-fenofibrate group， w

ith 16 rats in each group. Relevant treatments were given to rats 30 min before

myocardium ischemia operation respectively. A rat model of left anterior descend

ing coronary artery was ligated for 45 min and reperfused for 45 min to establis

h the model of ischemia-reperfusion. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） w

as respectively used to detect levels of NF-κB p65 and IL-6 in myocardium tissu

e； H·E staining is used to observe morphologic changes of myocardium cells in i

s

chemia/reperfusion injury region. Tunel staining was used to detect cardiac myoc

yte apoptosis rate （CMAR）.

Results The levels of NF-κB p65， IL-6 and CMAR in sham-operatio

n group were （8.11±0.83）pg/mg， （182.67±0.19）pg/mg and 0.79% respectiv

ely， which were significantly decreased compared with the other four groups （

P

and IL

-6， CMAR were significantly decreased in fenofibrate group （P

ey we

re significantly lower in 300mg/kg-fenofibrate group compared with 150 mg/kg-fe

nofibrate group （P

erfusion group and 300mg/kg-fenofibrate group were positively correlated （r1=0

.93， r2=0.74， P

Conclusions Fenofibrate may reduce the release of IL-6 throu

gh down-regulating NF-κB p65 levels， and prevent myocardium cell apoptosis， an

d eventually provide protection from ischemia/reperfusion injury.

[Key words] Fenofibrate； Myocardium ischemia/reperfusion； Nuc

lear factor κB p65； Interleukin-6； Cell apoptosis

心肌缺血再灌注损伤（ myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI ）是指心肌缺血后

恢复血液供应时心肌损伤较恢复前更为严重，继而引起细胞功能障碍甚至或细胞死亡的现象

，其发病机制方面的研究一直备受广大学者的关注?近年研究表明，炎症反应与MIRI的关系

已成为近年相关研究领域的热点[1] ?据Matsushima等[2]报道，过氧化

物酶体增殖物激活

型受体-α（Peroxisome proliferator-activated receptors-α，PPAR-α）激活后能从转录

水平抑制炎症因子反应，从而明显减轻心肌缺血引起的组织损伤[3]，但其具体机

制尚未阐

释清楚?本研究采取腹腔注射PPAR-α激动剂-非诺贝特，观察其对大鼠心肌缺血再灌注损伤

后炎性反应?细胞病理形态学及细胞凋亡的影响，进一步探讨非诺贝特心肌保护作用及其可

能机制?

1 材料与方法

1.1 材料：健康雄性SD大鼠64只（浙江大学医学院实验动物中心提供，SPF级，证书号：222

9601018）；NF-κB p65及IL-6 ELISA试剂盒（Sigma公司，美国）；非诺贝特（R&D Systems公

司，美国）；酶标仪（Heraeus公司，德国），Labo fuge 400R高速低温离心机（BioTek公司，

美国），原位末端标记（TUNEL）试剂盒（Promega公司，美国）；电子显微镜（OLYMPUS，日本）

等?

1.2 研究方法：

1.2.1 大鼠分组及处理：将64只SD大鼠（体重280～330g），按随机数表法分为4组（n=16）

，术前12小时禁食，但饮水自由?（1）假手术组：术前30min经腹腔注射300ml/kg的0.9%氯

化钠注射液；（2）缺血再灌注组：术前30min经腹腔注射300ml/kg的0.9%氯化钠注射液；（3

）150mg/kg非诺贝特组：术前30min经腹腔注射150mg/kg 非诺贝特；（4）300mg/kg非诺贝特组

：术前30min经腹腔注射300mg/kg非诺贝特?

1.2.2 建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型：按陈良万法[4]制备大鼠心肌缺血再

灌注损伤模型?经腹腔注射0.3ml/kg的10%水合氯醛进行麻醉，气管切开并插管，通气频率

65次/分，呼吸比1∶1.15，心电图监测?剖胸，带6-0线的眼科针在大鼠左冠状动脉起始部

下方1.5mm?穿行在左心耳与左肺动脉窦之间，其间置一塑料管，以止血钳夹紧，密切观察

左心室前壁心肌颜色改变及心电图变化?左心室前壁心肌组织颜色变暗，同时心电图示ST段

下降或抬高则判断为左冠状动脉结扎成功?45min后拔出塑料管，使左冠状动脉恢复血流45m

in，再灌注时局部心肌组织充血?假手术组大鼠只在左冠状动脉起始部下方1.5mm处穿线

，但不结扎，其他步骤同模型组?

1.3 评价指标：

1.3.1 测定心肌组织中NF-κB p65及IL-6的水平：各组大鼠再灌注结束后，随机抽取各

组8只大鼠，以4℃肝素化0.9%氯化钠注射液进行心脏快速灌洗，双肺变白后快速剪断心脏

，取左心室前壁心肌组织液氮冷冻后将组织匀浆上清液作为检测标本?检测步骤严格按ELIS

A试剂盒要求进行?

1.3.2 心肌组织H·E染色：将各组其余8只大鼠麻醉，以4℃肝素化0.9%氯化钠注射液进

行心脏灌洗，双肺变白后即换用4℃10%多聚甲醛快速灌洗固定至全身僵硬，并在左心室前壁

留取心肌组织作为检测标本制成蜡块?从心尖至心底部连续切片，厚约3μm?行常规H·E

染色后在光学显微镜下（×400）观察大鼠心肌细胞病理形态学变化并采图?

1.3.3 心肌组织Tunel染色：染色步骤严格按Tunel试剂盒检测步骤进行?心肌组织Tune

l染色后在光学显微镜下（×400）观察心肌细胞凋亡（以胞质出现棕黄染色颗粒代表）?每张切

片随机选取10个高倍视野，计数每个高倍镜视野内的阳性细胞核数?总的有核细胞数，计

算心肌细胞的凋亡率（每个高倍镜视野内的阳性细胞核数/总的有核细胞数×100%），取平

均值并采图?

1.4 统计学处理：应用SPSS 18.0版软件进行统计学分析?计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），

两两比较采用LSD-t检验，相关分析采用直线相关，以P

2 结果

2.1 非诺贝特对心肌组织中NF-κB p65及IL-6水平的影响：假手术组大鼠心肌组织中NF-

κB p65及IL-6水平均显著低于其余3组，差异有统计学意义（P

组大鼠相比，非诺贝特组预处理组大鼠NF-κB p65及IL-6水平均明显降低（P

随着用药剂量的增加而降低，两个不同剂量组比较，差异有统计学意义（P

组大鼠心肌组织中NF-κB p65及IL-6水平比较见表1?

2.2 缺血再灌注组及300 mg/kg 非诺贝特组大鼠心肌组织中NF-κB p65与IL-6水平的相关

性分析：缺血45min再灌注45min后，缺血再灌注组与300mg/kg非诺贝特组大鼠心肌组

织中NF-κB p65与IL-6水平均呈显著正相关，以NF-κB p65含量水平为自变量（independent

variable），用X表示?IL-6水平为因变量（dependent variable），用Y表示?求得回归方程

2.3 非诺贝特对大鼠心肌组织病理形态学改变的影响：假手术组左心室缺血再灌注区

心肌组织切片经H·E染色后可见心肌组织未见明显的出血?充血或炎性细胞的浸润，心

肌纤

维排列有序，肌节长度均匀?排列整齐，横纹清楚，细胞轮廓及胞核较清晰（图A）?缺血再

灌注组相应区域呈明显的缺血损伤性改变，间质充血或出血?水肿明显且有炎症细胞浸润，

大多数心肌纤维变长，排列紊乱甚至断裂，肌纤维间距不同程度增宽，而肌节缩短且排列不

整齐（图B）?150mg/kg非诺贝特组相应区域缺血性损伤程度明显轻于模型组，心肌纤维排

列较整齐，肌节排列亦较为规整，少见红细胞及炎性细胞浸润（图C），而300mg/kg非诺贝

特组的心肌缺血损伤程度明显轻于150mg/kg非诺贝特组?

2.4 非诺贝特对大鼠心肌细胞凋亡的影响：假手术组大鼠心肌组织中少见凋亡细胞（图A1）

，与其余3组大鼠相比差异均有统计学意义（P

（65.21±8.20）%，图B1，而150mg/kg非诺贝特组相应区域凋亡细胞阳性率（57.73±9.35

）%，图C1，两组相比差异均有统计学意义（P

非诺贝特组相应区域凋亡细胞阳性率（48.03±7.62%）显著高于150mg/kg非诺贝特组，两组

相比差异均有统计学意义（P

3 讨论

心肌缺血性疾病对患者的生活质量及生命健康造成严重影响?心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的

机制十分复杂，主要与炎症反应?细胞凋亡及坏死与心律失常及心功能降低等密切相关?

目前有研究报道，在心肌缺血初始阶段即激活炎症反应，而再灌注时受缺血缺氧及血液动力

学的改变引起心肌细胞释放大量炎症信号，促进炎性因子的聚集和释放[5]，明显

加剧了心

肌的炎症反应，从而加速心肌细胞的凋亡?既往研究表明，心肌缺血再灌注损伤过程中释放

的白细胞介素-6（IL-6）可作为急性心肌缺血性疾病患者预后判断的一个独立指标[6，7

]?本

研究也发现缺血再灌注组IL-6含量水平及细胞凋亡数相比较假手术组显著升高，由此我们推

测IL-6在心肌缺血再灌注损伤后对细胞凋亡的发生具有十分重要的意义?

作为信号传导途径中的重要因子之一，由多肽亚单位组成的核转录因子（nuclear transcrip

tion factor kappa B，NF-κB）在参与炎症?肿瘤及免疫的发生和发展?调节细胞凋亡等多

种生理及病理过程中具有重要作用?近期有研究报道，NF-κB的表达上调与多种与炎症反应

过程发挥重要作用的细胞因子有关[8]?本实验研究发现缺血再灌注组NF-κB p65

的水平与假手

术组相比明显升高，且与IL-6水平变化成显著正相关，这表明NF-κB p65在一定程度上是在

心肌缺血后被诱导释放进而促进IL-6的表达?

PPAR-α是PPARs的3个亚型之一，其分布较为广泛，主要分布在脂肪组织，但在心肌组织也

有一定量的表达[9]?研究发现，PPAR-α具有抑制心肌组织炎性细胞因子的表达及

心肌细胞肥大等重要作用[10，11]?非诺贝特（fenofibrate，FF）是PPAR-α选择性

激动剂，主要用于调节血脂?近来越来越多的研究表明非诺贝特可明显减轻心肌缺血引起的

组织损伤[3]，但

其具体机制尚未阐释清楚?本实验中经非诺贝特预处理后的大鼠左心室前壁组织中NF-κB p

65和IL-6的水平显著降低?二者水平变化呈明显的正相关性，并且心肌细胞凋亡数量明显减

少，由此我们认为非诺贝特具有降低诱发NF-kB p65的释放能力，进而降低IL-6的含量水平

，达到减少心肌细胞凋亡的作用；且两个不同剂量组比较，差异有统计学意义（P

）?提示非诺贝特对心肌再灌注损伤的保护作用随着用药剂量的增加而增强?

同时，病理学观察结果中，缺血再灌注组大鼠在心肌缺血再灌注损伤后的心肌细胞发生了明

显的细胞空泡变性坏死，符合心肌细胞缺血缺氧性病理学变化；而经非诺贝特预处理组的

大鼠则以心肌细胞肿胀为主，且300mg/kg 非诺贝特组的心肌损伤程度明显轻于150mg/kg非

诺贝特组（P

少心肌缺血再灌注损伤具有积极意义，其保护作用与剂量有一定的相关性?

综上所述，非诺贝特通过激活PPAR-α后下调心肌缺血再灌注损伤组织中NF-κB p65的释放

，进一步降低促炎介质（IL-6）的含量水平，有效缓解了大鼠缺血再灌注后的损伤，从而减少

心肌细胞凋亡，为其在缺血性心血管疾病的临床使用中提供参考依据?

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