动脉粥样硬化兔不同金属基质蛋白酶动态变化的探讨

【摘 要】目的探讨不同基质金属蛋白酶在动脉硬化兔模型的动态变化。方法 高脂喂食加球囊拉伤股动脉建立动脉硬化兔模型，分别于拉伤后1、7、14、21、28 d采血，ELISA法检测MMP-1、2、8、9，TIMP-1，绘制MMPs动态变化曲线，并取血管行病理检查。结果 MMP-1、9，TIMP-1在拉伤后1 d均达到峰值，延续至拉伤后7 d；三者衍变曲线相似，且有相关性；MMP-2、8在各采血点无差异。结论 MMP-1、9，TIMP-1的动态变化规律可为研究动脉硬化不稳定斑块提供依据。

【关键词】 基质金属蛋白酶；动脉硬化；兔；动态

Dynamic changes of matrix metalloproteinses in atherosclerosis rabbit modelCHEN Jun, XU Zhao-yan. The First people′s Hospital of Feshan City, Guangdong Province, Feshan 528333, China

【Abstract】 Objective To search the dynamic changes of the matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases-1 (TIMP-1) of the atherosclerosis rabbit model．Methods Atherosclerosis models of rabbits were established through high lipid diet and injured femoral arteries by dilated balloon，and on day 1，7，14，21，28 after injured，MMP1，2，8，9 and TIMP-1 were detected with ELISA assay，then the curve reflecting the dynamic changes was draw，and the histopathology data was provided as well．Results The curve of dynamic changes MMP-1，9，and TIMP-1 were similar，the peaks were showed at 1 day after injured，and last for 7 days；there are relative among them；no obvious changes were showed in MMP-2，8．Conclusion The characteristic of dynamic changes of MMP-1,9 and TIMP-1 could provide evidence for search the vulnerable plaque．

【Key words】 Matrix metalloproteinases；Atherosclerosis；Rabbitdynamic

斑块破裂导致血小板聚集是急性冠脉综合征的病理生理学基础，较多的研究显示金属基质蛋白酶（MMPs）是斑块破裂敏感性和特异性都很高的指标[1，2]，但对不同MMPs在斑块破裂的动态变化的比较鲜有报道，本研究旨在对此进行探讨。

1 材料与方法

1．1 材料 新西兰兔30个，普通级，体质量1．5～2．2 kg,由广东省医学实验动物中心提供，合格证号:SCXK（粤）2003002；药盒由Aditteram Diagnostic Laboratorie Inc．提供，使用酶联免疫（ELISA）法测定MMP-1，MMP-2，MMP-8，MMP-9，TIMP-1的浓度，生化仪使用德国半自动酶标仪HUNAREADER，底板机使用全自动酶标底板2310。

1．2 动脉粥样硬化模型的建立和检测 30个新西兰兔进食高脂饲料（配方为：5%猪油，2%胆固醇，93%的基础饲料，颗粒饲料由广东省医学实验动物中心配制）。建模前耳缘静脉测定血清中胆固醇（TC）和三酰甘油（TG）的含量，2周后再次采血TC、（TG）的含量，证实实验兔组比对照组明显升高后继续进食高脂饲料4周。

1．3 动物拉伤模型的制备 共分成 5组，分别为1、7、14、21、28 d组，每组5个。球囊拉伤前3 d，动物灌服阿司匹林25 mg/只。肌内注射速眠新Ⅱ0．35 ml/kg进行麻醉。结扎股动脉远端，股动脉切开小口，逆行置入0．014 cm×190 cm BMW (Gaident)的导丝至胸腹主动脉，并在导丝引导下置入球囊导管3．0 mm×12 mm Sprinter ( Metronic) 置于腹主动脉内。通过压力泵向球囊内注入肝素生理盐水，维持压力10 atm并缓慢回拉球囊导管10 cm。拉伤血管后，抽出球囊内液体，使压力为0。重复上述拉伤过程3次，撤出球囊导管。术后缝合皮下组织及皮肤。

1．4 标本采集 造模后的第1、7、14、21、28天处死的动物。腹主动脉采血，离心取血清，送检。取拉伤主动脉，用10％的甲醛进行固定，送检。

1．5 形态学检测 所有标本送至广州中医药大学病理教研室检测,应用OLYMPUS CX21 显微镜、Nikon eclipse TE2000-S 显微摄影系统、ACT-2U图像采集系统。

1．6 统计学方法 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，使用t检验和χ2分析，组间比较用多个样本均数两两比较q检验。采用SPSS 11．0 统计软件进行分析,双侧P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 不同天数组MMPs比较 见表1。

2．1．1 MMP-1 MMP-1在术后1 d即明显升高且达到峰值，7 d开始下降，但与1 d组差异无统计学意义(P=0．427)，14、21、28 d组之间差异无统计学意义，但与1、7 d组比较差异有统计学意义(P＜0．05）。

2．1．2 MMP-2 MMP-2在术后1 d开始升高，但1、7、14、21、28 d组差异均无统计学意义（P＝0．385）。

2．1．3 MMP-8 MMP-8在术后1 d开始升高，7 d时到达高峰，但1、7、14、21、28 d组差异无统计学意义 (P=0．062)。

2．1．4 MMP-9 MMP-9在术后1 d出现峰值，维持至术后7 d，两组比较（P=0．861），14、21 d开始下降，与1、7 d组比较差异有统计学意义。

2．1．5 TIMP-2 TIMP-1术后1 d开始升高，7 d开始明显下降，两组比较（P=0．125），14、21 d组继续下降。

2．2 MMPs/TIMP-1动态变化曲线 见图1。

2．3 病理结果 ①术后1 d主要表现为血管壁拉伤损害，开始出现内皮下间质细胞反应性增生。②术后7 d可见间质细胞增生增加，形成小斑块，向管腔突出。③术后14、21、28 d大致相似，可见内皮下间质细胞增生明显，伴有脂质沉积及泡沫细胞形成，形成较大斑块，血管内壁不均匀突起致血管腔狭窄且不规则，其中1个标本见血管腔阻塞。

3 讨论

MMPs是一类生物活性依赖于锌离子、降解细胞外基质能力的酶系家族，至今已识别的超过20余种。MMPs参与很多心血管疾病，包括动脉粥样硬化、心室重构、心力衰竭及心房颤动等。其中研究比较深入的是MMPs与动脉硬化粥样斑块破裂、急性冠脉综合征（ACS）的联系。认为MMPs降解了不稳定斑块纤维帽肩部的细胞外基质，从而诱发斑块破裂，在临床上出现ACS[3-4]。

从本研究病理结果可见，血管拉伤后首先表现为平滑肌断裂，继而出现炎性反应，间质细胞增生，泡沫细胞形成，斑块形成及增大。从各MMPs动态分析，MMP-1、8同属胶原酶，但损伤后浓度变化曲线形态不同，而MMP-2、9同属于明胶酶，浓度从拉伤后1 d后即达到峰值，浓度变化曲线也可见差别，而MMP-9与MMP-1相似，作为MMPs抑制物的TIMP-1的动态变化曲线也跟MMP-1、9相似。Galis ZS等提出血管平滑肌细胞和单核巨噬细胞MMPs产物的上调可分4个阶段，由MMP-1等首先分解细胞外基质，启动胶原降解，使三联纤维网状结构断裂，继而上调的是明胶酶，包括明胶酶A、明胶酶B，随后是更广谱的MMPs激活使基质破坏[5]，而这过程中，大量的炎性细胞因子如白细胞介素-1、4（IL-1、4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）参与介导，而血小板源生长因子（PDGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）也起了协同作用[6]。Newby AC[7]等提出在高胆固醇饮食的粥样硬化兔模型中MMP-1、9的表达明显增加，而人动脉硬化斑块中MMP-1、9也呈现分泌明显增加。结合本实验，MMP-1、9的动态变化曲线相似，考虑在动脉硬化粥样斑块破裂的模型中，MMP-1、9动态变化可反映斑块的衍变过程。而TIMP由分泌MMPs的细胞按1∶1比例同时分泌，调节MMPs的活性，而TIMP-1主要调节MMP-1、9[3]，与实验结果显示MMP-1、9，TIMP-1的动态衍变有相关性相符合。本实验通过建立动脉粥样硬化模型，提供了MMPs/TIMP-1的动态变化规律的资料，从而为不稳定粥样斑块的早期防治提供依据。

参考文献

1 Williams TN，Zhang CX，Game BA，et al．C-reactive protein stimulates MMP-1 expression in U937 histiocytes through Fc〔gamma〕RII and extracellular signal-regulated kinase pathway：an implication of CRP involvement in plaque destabilization．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(1):61-6．

2 Hojo Y，Ikeda U，Ueno S，et al．Expression of matrix metalloproteinases in patients with acute myocardial infarction．Jpn Circ J，2001，65(2):71-5．

3 Blankenberg S，Rupprecht HJ，Poirier O，et al．Plasma concentrations and genetic variation of matrix metalloproteinase 9 and prognosis of patients with cardiovascular disease．Circulation，2003:107(12):1579-85．

4 Kuzuya M，Kanda S，Sasaki T，et al．Deficiency of gelatinase a suppresses smooth muscle cell invasion and development of experimental intimal hyperplasia．Circulation，2003，108(11):1375-81．

5 Sukhova GK，Schonbeck U,Rabkin E,et al．Evidence for increased collagenolysis by interstitial collagenases-1 and -3 in vulnerable human atheromatous plaques．Circulation,1999，99(19):2503-9．

6 Newby AC．Dual role of matrix metalloproteinases (matrixins) in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture．Physiol Rev，2005，85(1):1-31．

7 Newby AC，Zaltsman AB．Fibrous cap formation or destruction-the critical importance of vascular smooth muscle cell p roliferation，migration and matrixformation．Cardiovas Res，1999,41(2)：345-360．