山东省零售肉类样品中分离、鉴定携带志贺毒素基因(stx)的O157和非O157大肠杆菌

时间:2022-10-01 10:04:49

山东省零售肉类样品中分离、鉴定携带志贺毒素基因(stx)的O157和非O157大肠杆菌

【摘要】实验采用DNA探针杂交技术,对购买的53个市售肉类样品进行检测,31个(58%)样品检测出含有stx基因的大肠杆菌,其中牛肉检出率最高(68%)。分离的42株携带stx基因的大肠杆菌,均不是O157。使用O157特异免疫磁珠技术,从8个牛肉样品中分离到携带eae和stx2基因的大肠杆菌O157。

【关键词】产志贺毒素大肠杆菌;O157特异免疫磁珠技术;DNA探针杂交技术

产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的自然宿主是牛和其他动物,因此,零售的肉类可能被STEC污染[2]。尽管STEC包含超过200种O:H血清型,但大部分与严重的人类疾病没有关系。肠出血性大肠杆菌(EHEC)属于含编码紧密黏附素的eae基因的STEC,可以引起严重的胃肠道疾病。由EHEC感染的病例部分是由志贺毒素(Stx)引起。O157:H7/-(H7或H阴性)是EHEC中主要的血清型,可是H抗原很难检测,并且检测之前的动力实验可能导致H抗原丢失。因此,STEC中携带eae基因的O157血清型,作为典型的EHEC菌株,引起人们的极大关注。

本次实验研究了购买自山东省零售肉类样品中非O157和O157的分布情况,筛选了携带stx基因的非O157和O157大肠杆菌,检测了stx1、stx2和eae基因,通过RPLA方法确认了产生Stx1和Stx2毒素的能力。Stx2毒素阴性的STEC O157被发现,鉴定这些菌株将为研究携带stx2基因,却缺乏Stx2毒素的机制提供新的信息。

1、材料和方法

1.1菌株

大肠杆菌O157:H7菌株Thai-12,作为不产Stx2毒素的代表性的阴性对照。

1.2肉类样品中含stx基因大肠杆菌的检测

肉类样品购自青岛当地的超市和市场。25g样品加入225mL胰蛋白胨大豆肉汤(TSB),37℃培养6h。取1mL该增菌液接种10mL TSB,42℃培养2h,作为第二次增菌液。取2次增菌液分别接种DHL琼脂和麦康凯琼脂,37℃培养18~24h。

从每个平板选取40~160个疑似大肠杆菌菌落接种至尼龙膜(Hybond-N+),置于含1%NaCl的Luria-Bertani(LB)琼脂,14℃培养18h。尼龙膜置于含0.5M NaOH的溶解液10min,之后用含1.0M Tris-HCl(pH 7.0)的中和液中和1min,重复3次,最后置于含1.0M Tris-HCl(pH 7.0)和1.5M NaCl的变性液10min。将膜置于80℃固定DNA 2h。每个DNA菌落印迹与含地高辛标记的stx1和stx2基因探针进行杂交。

标准的生化试验鉴定为大肠杆菌之后进行stx1和/或stx2基因阳性分离。生化试验包括传统的吲哚试验、甲基红试验、VP试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶试验和三糖铁试验。符合上述特性的分离物确定为STEC。

为了定量检测肉中的STEC,25g样品加入225mLTSB,均质1min,运用MPN法检测STEC,按照上述方法鉴别,根据MPN检索表读数。

1.3肉类样品中含stx基因大肠杆菌O157的选择性分离

取1.2中第二次增菌液1mL与包被抗O157抗体的免疫磁珠(Dynabeads)连续搅动反应10min,将免疫磁珠置于CHROMagar O157琼脂培养,紫色的菌落按照下述PCR方法筛选stx1和stx2基因,PCR阳性的按照下述方法确定是否为O157,确定含有O157的按照上述方法确实是否为大肠杆菌。符合上述特性的分离物确定为含stx基因大肠杆菌O157。

1.4STEC的鉴定

运用PCR方法检测STEC中stx1、stx2和eae基因,运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素,运用凝集实验检测O157抗原,运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法检测DNA指纹,这些方法描述如下。

运用PCR方法,检测菌株于5mL LB肉汤37℃振荡(150rpm)培养过夜,培养物煮沸10min,800g离心10min,取上清液检测。使用商业合成的引物检测stx基因,EVT-1和EVT-2检测stx1基因,EVS-1和EVS-2检测stx2基因(TaKaRa Biochemicals)。PCR扩增,按照引物生产商提供的程序,用1.5%的琼脂糖凝胶检测特异的扩增产物。eae基因使用AE19和AE20引物扩增该基因内1,087bp的序列。扩增程序如下:预变性96℃35min,设置35个循环,94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,循环结束后最终72℃延伸7min。

运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素,检测菌株于酸酵母提取物培养基36℃振荡(130rpm)培养过夜。800g离心10min。上清液中的Stx毒素使用商业化RPLA试剂盒(VTEC-RPLA)检测。Stx毒素滴度以出现连续阳性反应的最高稀释度定义。

运用凝集实验检测O157抗原,是通过高压过的菌体和抗O157血清凝集检测。

为了获得总菌体DNA的指纹,将36℃振荡(130rpm)培养过夜的LB肉汤培养的菌株做PFGE同时用XbaI酶切。

2、结果

2.1肉类样品中含stx基因大肠杆菌的检测

53个牛肉、羊肉、猪肉和鸡肉样品用于含stx基因大肠杆菌的检测,使用“STEC”作为携带stx1和/或stx2基因大肠杆菌的缩写。58%的样品分离到STEC,其中牛肉的分离率最高(68%),鸡肉的最低(0%),见表1。

表1 肉类样品中STEC的分离

肉 STEC阳性样品数/检测样品数(%)

牛肉 21/31(68)

羊肉 7/12(58)

猪肉 3/8(38)

鸡肉 0/2(0)

总计 31/53(58)

随机选择的3个牛肉样品MPN法得到的STEC结果为2.3,9.3和15/g。同一个样品分离得到的1株以上的菌株,如果基因型不同(携带或缺乏stx1、stx2和eae基因)和/或PFGE分型不同,则被定义为不同的菌株。31个样品中分离到42株STEC,所有的菌株为STEC非O157,缺乏eae基因,并且stx基因型(stx1和/或stx2)不同。

2.2肉类样品中含stx基因大肠杆菌O157菌株的分离和鉴定

使用对O157特异吸附的免疫磁珠技术,从53个肉类样品中分离STEC O157。8个牛肉样品中,每个分离得到1株STEC O157,其他肉类样品没有得到。这8株STEC O157具有相同的stx基因型(缺乏stx1,携带stx2)并且携带eae基因。

8株STEC O157和从42株STEC非O157不同stx基因型的菌株中随机挑选16株,运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素水平,见表2。STEC O157菌株不产生Stx2毒素(Stx2滴度

3、讨论

本研究对不同肉类样品中分离出STEC非O157的比例为58%。目前,国内关于该方面的研究报道很少。其他国家的研究调查显示,零售肉的STEC非O157:H7的检出率为63%。因此,对包括非O157在内的STEC需要开展更广泛的研究。

应用O157特异吸附的免疫磁珠分离技术检测牛肉样品中STEC O157的结果表明,STEC中STEC O157的比例很低,仅占26%。马来西亚的一项研究表明,36%的零售牛肉样品中检测到携带stx2基因的STEC O157[3]。一项全球研究的结果显示,牛肉中大肠杆菌O157的检出率为0.1~54.2%[4]。还有数据显示,亚洲国家牛肉中STEC O157的检出相对较高。STEC O157菌株是否产Stx毒素,是体现STEC O157毒性非常重要的特征。我们通过对基因型分析得出结论,本次研究分离得到的8株STEC O157均属于不产生或产生Stx2毒素很少的“Stx2毒素阴性”菌株。周志江教授[1]对中国零售肉类样品中STEC O157的研究表明,吉林省牛肉和猪肉样品中STEC O157的检出率分别为5%和3.3%,产生Stx2毒素滴度较高(RPLA滴度,160~2560),并且“Stx2毒素阴性”菌株产Stx2毒素的能力也不尽相同,因此需要对STEC O157产生Stx2毒素开展更广泛的研究。

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