山东省零售肉类样品中分离、鉴定携带志贺毒素基因(stx)的O157和非O157大肠杆菌

【摘要】实验采用DNA探针杂交技术，对购买的53个市售肉类样品进行检测，31个（58%）样品检测出含有stx基因的大肠杆菌，其中牛肉检出率最高（68%）。分离的42株携带stx基因的大肠杆菌，均不是O157。使用O157特异免疫磁珠技术，从8个牛肉样品中分离到携带eae和stx2基因的大肠杆菌O157。

【关键词】产志贺毒素大肠杆菌；O157特异免疫磁珠技术；DNA探针杂交技术

产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的自然宿主是牛和其他动物，因此，零售的肉类可能被STEC污染[2]。尽管STEC包含超过200种O：H血清型，但大部分与严重的人类疾病没有关系。肠出血性大肠杆菌（EHEC）属于含编码紧密黏附素的eae基因的STEC，可以引起严重的胃肠道疾病。由EHEC感染的病例部分是由志贺毒素（Stx）引起。O157：H7/-（H7或H阴性）是EHEC中主要的血清型，可是H抗原很难检测，并且检测之前的动力实验可能导致H抗原丢失。因此，STEC中携带eae基因的O157血清型，作为典型的EHEC菌株，引起人们的极大关注。

本次实验研究了购买自山东省零售肉类样品中非O157和O157的分布情况，筛选了携带stx基因的非O157和O157大肠杆菌，检测了stx1、stx2和eae基因，通过RPLA方法确认了产生Stx1和Stx2毒素的能力。Stx2毒素阴性的STEC O157被发现，鉴定这些菌株将为研究携带stx2基因，却缺乏Stx2毒素的机制提供新的信息。

1、材料和方法

1.1菌株

大肠杆菌O157：H7菌株Thai-12，作为不产Stx2毒素的代表性的阴性对照。

1.2肉类样品中含stx基因大肠杆菌的检测

肉类样品购自青岛当地的超市和市场。25g样品加入225mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），37℃培养6h。取1mL该增菌液接种10mL TSB，42℃培养2h，作为第二次增菌液。取2次增菌液分别接种DHL琼脂和麦康凯琼脂，37℃培养18～24h。

从每个平板选取40～160个疑似大肠杆菌菌落接种至尼龙膜（Hybond-N+），置于含1%NaCl的Luria-Bertani（LB）琼脂，14℃培养18h。尼龙膜置于含0.5M NaOH的溶解液10min，之后用含1.0M Tris-HCl（pH 7.0）的中和液中和1min，重复3次，最后置于含1.0M Tris-HCl（pH 7.0）和1.5M NaCl的变性液10min。将膜置于80℃固定DNA 2h。每个DNA菌落印迹与含地高辛标记的stx1和stx2基因探针进行杂交。

标准的生化试验鉴定为大肠杆菌之后进行stx1和/或stx2基因阳性分离。生化试验包括传统的吲哚试验、甲基红试验、VP试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶试验和三糖铁试验。符合上述特性的分离物确定为STEC。

为了定量检测肉中的STEC，25g样品加入225mLTSB，均质1min，运用MPN法检测STEC，按照上述方法鉴别，根据MPN检索表读数。

1.3肉类样品中含stx基因大肠杆菌O157的选择性分离

取1.2中第二次增菌液1mL与包被抗O157抗体的免疫磁珠（Dynabeads）连续搅动反应10min，将免疫磁珠置于CHROMagar O157琼脂培养，紫色的菌落按照下述PCR方法筛选stx1和stx2基因，PCR阳性的按照下述方法确定是否为O157，确定含有O157的按照上述方法确实是否为大肠杆菌。符合上述特性的分离物确定为含stx基因大肠杆菌O157。

1.4STEC的鉴定

运用PCR方法检测STEC中stx1、stx2和eae基因，运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素，运用凝集实验检测O157抗原，运用脉冲场凝胶电泳（PFGE）方法检测DNA指纹，这些方法描述如下。

运用PCR方法，检测菌株于5mL LB肉汤37℃振荡（150rpm）培养过夜，培养物煮沸10min，800g离心10min，取上清液检测。使用商业合成的引物检测stx基因，EVT-1和EVT-2检测stx1基因，EVS-1和EVS-2检测stx2基因（TaKaRa Biochemicals）。PCR扩增，按照引物生产商提供的程序，用1.5%的琼脂糖凝胶检测特异的扩增产物。eae基因使用AE19和AE20引物扩增该基因内1，087bp的序列。扩增程序如下：预变性96℃35min，设置35个循环，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环结束后最终72℃延伸7min。

运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素，检测菌株于酸酵母提取物培养基36℃振荡（130rpm）培养过夜。800g离心10min。上清液中的Stx毒素使用商业化RPLA试剂盒（VTEC-RPLA）检测。Stx毒素滴度以出现连续阳性反应的最高稀释度定义。

运用凝集实验检测O157抗原，是通过高压过的菌体和抗O157血清凝集检测。

为了获得总菌体DNA的指纹，将36℃振荡（130rpm）培养过夜的LB肉汤培养的菌株做PFGE同时用XbaI酶切。

2、结果

2.1肉类样品中含stx基因大肠杆菌的检测

53个牛肉、羊肉、猪肉和鸡肉样品用于含stx基因大肠杆菌的检测，使用“STEC”作为携带stx1和/或stx2基因大肠杆菌的缩写。58%的样品分离到STEC，其中牛肉的分离率最高（68%），鸡肉的最低（0%），见表1。

表1 肉类样品中STEC的分离

肉 STEC阳性样品数/检测样品数（%）

牛肉 21/31（68）

羊肉 7/12（58）

猪肉 3/8（38）

鸡肉 0/2（0）

总计 31/53（58）

随机选择的3个牛肉样品MPN法得到的STEC结果为2.3，9.3和15/g。同一个样品分离得到的1株以上的菌株，如果基因型不同（携带或缺乏stx1、stx2和eae基因）和/或PFGE分型不同，则被定义为不同的菌株。31个样品中分离到42株STEC，所有的菌株为STEC非O157，缺乏eae基因，并且stx基因型（stx1和/或stx2）不同。

2.2肉类样品中含stx基因大肠杆菌O157菌株的分离和鉴定

使用对O157特异吸附的免疫磁珠技术，从53个肉类样品中分离STEC O157。8个牛肉样品中，每个分离得到1株STEC O157，其他肉类样品没有得到。这8株STEC O157具有相同的stx基因型（缺乏stx1，携带stx2）并且携带eae基因。

8株STEC O157和从42株STEC非O157不同stx基因型的菌株中随机挑选16株，运用RPLA方法检测Stx1和Stx2毒素水平，见表2。STEC O157菌株不产生Stx2毒素（Stx2滴度

3、讨论

本研究对不同肉类样品中分离出STEC非O157的比例为58%。目前，国内关于该方面的研究报道很少。其他国家的研究调查显示，零售肉的STEC非O157：H7的检出率为63%。因此，对包括非O157在内的STEC需要开展更广泛的研究。

应用O157特异吸附的免疫磁珠分离技术检测牛肉样品中STEC O157的结果表明，STEC中STEC O157的比例很低，仅占26%。马来西亚的一项研究表明，36%的零售牛肉样品中检测到携带stx2基因的STEC O157[3]。一项全球研究的结果显示，牛肉中大肠杆菌O157的检出率为0.1～54.2%[4]。还有数据显示，亚洲国家牛肉中STEC O157的检出相对较高。STEC O157菌株是否产Stx毒素，是体现STEC O157毒性非常重要的特征。我们通过对基因型分析得出结论，本次研究分离得到的8株STEC O157均属于不产生或产生Stx2毒素很少的“Stx2毒素阴性”菌株。周志江教授[1]对中国零售肉类样品中STEC O157的研究表明，吉林省牛肉和猪肉样品中STEC O157的检出率分别为5%和3.3%，产生Stx2毒素滴度较高（RPLA滴度，160～2560），并且“Stx2毒素阴性”菌株产Stx2毒素的能力也不尽相同，因此需要对STEC O157产生Stx2毒素开展更广泛的研究。