GW9662对正常人和甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响

摘要：目的：研究GW9662对正常人和甲状腺相关眼病（Thyroid-associated Ophthalmolpathy， TAO）患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法：培养正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞，在其增殖和分化的过程中加入GW9662。MTT法观察GW9662对前脂肪细胞增殖的影响，油红O染色定量的方法观察GW9662对前脂肪细胞分化的影响。结果：各浓度实验组的GW9662对眼眶前脂肪细胞的增殖影响较小，各组数据间差异无统计学意义。在各个实验时间段， GW9662对眼眶前脂肪细胞有抑制分化的作用，在48h时作用最明显。与正常人比较，GW9662对TAO患者眼眶前脂肪细胞的抑制分化作用更明显。结论：GW9662可抑制正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞的分化，并可能缓解因眼眶前脂肪细胞过度分化导致的TAO临床症状。

关键词：GW9662；眼眶；前脂肪细胞；细胞增殖；细胞分化

眼眶内脂肪组织的增生是引起TAO眶内容体积增加的重要因素，该过程的发生与眼眶内成熟脂肪细胞的前体细胞——前脂肪细胞的分化增强有关。其中，TAO患者眼眶前脂肪细胞及其分化过程中转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）表达的增强在该过程中起重要作用。GW9662是PPARs的拮抗剂，可以竞争性结合PPARs配体结合域，从而阻断PPARs配体的作用途径。已有动物模型及实验研究证明GW9662可抑制脂肪细胞的分化[1，2]。本实验研究GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞增殖和分化的影响，以期为临床研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1眼眶脂肪组织取自行眼球摘除术的患者眼眶，共4例4眼，年龄38～45（平均42）岁。TAO眼眶脂肪组织取自眼眶减压术中，病情分级均为6级，共4例4只眼，年龄37～48（平均44）岁。主要试验材料：DMEM /F-12（1：1）培养液、地塞米松、异丁基甲基次黄嘌呤（IBMX）、转铁蛋白、泛酸钙、三碘甲状腺原氨酸（T3）、生物素、胰岛素、油红O、匹格列酮、MTT粉购自Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；二甲基亚砜溶液（DMSO）购自上海生工。

1.2 人眼眶前脂肪细胞的原代、传代培养和向成熟脂肪细胞的诱导分化 采用组织块贴壁法培养人眼眶前脂肪细胞并进行诱导分化， 取3～5代的传代细胞进行实验。

1.3 GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞增殖的影响

将GW9662溶于DMSO中配制成浓缩液，取浓缩液溶解于完全培养液， 终浓度分别为0.1μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L 和10μmol/L 。将前脂肪细胞以5×104/L的密度传代接种于96孔板，每孔100μL。37℃、5%CO2培养12h，换基础培养基继续培养3d，按预先设组分别加入各浓度GW9662干预培养液，设无药物干预培养液为对照组，仅加培养液的空白孔为调零孔。24h， 48h， 72h时，用MTT比色法测定各时相点吸光度的平均值A（表示细胞相对数量），7复孔取平均值。

1.4 GW9662对正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞分化的影响

按上述浓度将GW9662浓缩液溶解于诱导分化培养液，无药物干预培养液为对照组，仅加培养液的空白孔为调零孔。将前脂肪细胞以5×104/L的密度传代接种于96孔板，每孔100μL。用完全培养基培养细胞至生长融合2～3d后，改用含各浓度GW9662干预培养液进行诱导分化，13d结束分化。取各组分化细胞各7孔，用40g/L等渗甲醛固定1h，然后蒸馏水漂洗。加入油红O浸泡2h后，三蒸水漂洗数次。置于温箱中蒸发掉多余的水分后，加入异丙醇萃取，用紫外线分光光度计在波长为510nm处测量吸光度（A）。

1.5 GW9662拮抗匹格列酮对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞分化的影响

将上述诱导分化细胞用含10μmol/L的匹格列酮和10μmol/L GW9662的干预培养液进行诱导分化，13d结束分化。取各组分化细胞各7孔，用40g/L等渗甲醛固定1h，然后蒸馏水漂洗。加入油红O浸泡2h后，三蒸水漂洗数次。置于温箱中蒸发掉多余的水分后，加入异丙醇萃取，用紫外线分光光度计在波长为510nm处测量吸光度OD值（A）。

统计学分析：各实验独立重复3次以上，析因设计方差分析比较各不同处理组间及正常人与TAO患者前脂肪细胞间的差异。所有统计分析由SPSS11.0统计软件分析完成，检验水准ɑ=0.05。

2 结果

2.1 GW9662对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞增殖的影响

GW9662浓度分别为0.1μmol/L，1μmol/L ，10μmol/L和50μmol/L时，48h测定不同浓度匹格列酮对前脂肪细胞增殖的影响。MTT结果显示，浓度为0.1μmol/L，1μmol/L 和10μmol/L时，GW9662对各组细胞的增殖影响较小，各组数据间差异无统计学意义（P>0.05）（表1），当浓度为50μmol/L时，细胞的增殖受到明显抑制，部分细胞呈现脱壁。

2.2 GW9662对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞分化的影响

用0.1μmol/L，1μmol/L ，10μmol/L和50μmol/L浓度的GW9662刺激前脂肪细胞分化，油红O染色定量方法测定结果显示，当浓度达到1μmol/L后GW9662呈浓度依赖性对对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞的分化起到抑制作用（表2）。当浓度为50μmol/L时，细胞分化受到明显抑制，部分细胞呈现脱壁。与正常人比较，GW9662对TAO患者眼眶前脂肪细胞的抑制分化作用更显著（P

2.3 GW9662拮抗匹格列酮对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞分化的影响

用10μmol/L浓度的匹格列酮和10μmol/L浓度的GW9662混合液干预前脂肪细胞分化，油红O染色定量方法测定结果显示，GW9662能够有效地抑制匹格列酮对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞的促分化作用（表3）。

3 讨论

脂肪细胞分化是多种因素共同作用的过程，包括转录因子的表达和活性表达、激素和细胞因子的相互作用等，转录因子表达的变化在其中起到决定性作用。PPARs是最重要的分化转录因子，主要表达在脂肪细胞，在调控脂肪细胞的分化过程中起到重要作用。有报道显示， TAO患者眼眶内表达增强的PPARs导致了眼眶内的脂肪细胞异常分化，并参与了TAO的发病过程[3-5]。

GW9662是PPARs的拮抗剂，通过竞争性结合PPARs配体结合域阻断了PPARs配体的作用效应，从而抑制了脂肪细胞的分化过程。

本实验应用正常人和TAO患者眼眶前脂肪细胞进行研究，并比较GW9662对这两种细胞分化作用的差异。结果显示，GW9662对体外培养的人眼眶前脂肪细胞增殖过程无明显作用，未参与到影响人眼眶前脂肪细胞的增殖的机制。在浓度为1μmol/L 和10μmol/L时， GW9662对各组细胞的分化有抑制作用，在浓度为10μmol/L时抑制作用更强。与正常人比较，GW9662对TAO患者眼眶前脂肪细胞的抑制分化作用更明显，进一步证实了TAO患者眼眶前脂肪细胞中表达有较高水平的PPARs。因此我们认为，TAO眶内前脂肪细胞不仅表达有增高的PPARs，而且该PPARs是具有活性的，可以被其增敏剂或拮抗剂激活或封闭。

匹格列酮是目前临床上常用的噻唑烷二酮类（ thiazolinediones， TZDs）药物，是一种有效的胰岛素增敏剂，主要作用于脂肪细胞的PPARs，通过激活PPARs活化多种与脂质和糖代谢有关的基因表达，促进脂肪细胞分化，使得成熟脂肪细胞的生成增多。以往的实验研究表明，匹格列酮对TAO患者和正常人眼眶前脂肪细胞的增殖和分化有促进作用[6]。我们将浓度为10μmol/L的匹格列酮和GW9662混合干预诱导分化，发现GW9662可以拮抗匹格列酮促进眶内前脂肪细胞分化的作用，推测这可能是由于GW9662与PPARs结合后阻断了匹格列酮与PPARs的进一步结合，从而阻止了匹格列酮对前脂肪细胞的促分化作用所致，该结果也提示GW9662较匹格列酮能有效地与PPARs结合，对PPARs结合位点更有亲和力。

综上所述，GW9662作为PPARs的拮抗剂，能够有效地抑制眶内前脂肪细胞的分化过程，从而减轻眶内容体积的扩增，若能运用于临床，将有可能通过抑制脂肪形成来改善和预防TAO的病程过程。

参考文献

[1] Xiao Y， Yuan T， Yao W， et al.3T3-L1 adipocyte apoptosis induced by thiazolidinediones is peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-dependent and mediated by the caspase-3-dependent apoptotic pathway. FEBS J.2010 Feb；277（3）：687-96.

[2]Wright HM， Clish CB， Mikami T， et al. Synthetic antagonist for the peroxisome proliferator activated receptor-inhibits adipocyte differentiation. J Biol Chem，2000，275（4）：1873–1877.

[3]Pasquali D， Pierantoni GM， Fusco A， et al. Fenofibrate increases the expression of high mobility group AT-hook 2 （HMGA2） gene and induces adipocyte differentiation of orbital fibroblasts from Graves' ophthalmopathy . J Mol Endocrinol， 2004， 33（1）：133-143.

[4] Kumar S. Leontovich A. Coenen MJ ， et al. Gene expression profiling of orbital adipose tissue from patients with Graves' ophthalmopathy： a potential role for secreted frizzled-related protein-1 in orbital adipogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 2005；90：4730–4735.

[5] Kumar S. Coenen MJ. Scherer PE， et al. Evidence for enhanced adipogenesis in the orbits of patients with Graves' ophthalmopathy. J Clin Endocrinol Metab. 2004；89：930–935.

[6] Starkey K， Heufelder A， Baker G， et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in thyroid eye disease： contraindication for thiazolidinedione use？ J Clin Endocrinol Metab，2003，88（1）：55-59.