原花青素(OPC)抑制紫外线辐射后表皮黑素细胞黑素合成的实验研究

[摘要]目的：研究葡萄籽提取物原花青素（OPC）对正常表皮黑素细胞以及紫外线辐射后表皮黑素细胞黑素合成的影响。方法：培养的正常表皮黑素细胞和经10mJ/cm2紫外线辐射后的表皮黑素细胞分别以高中低（10、50、100μg/ml）三种浓度的OPC作用72 h，测定细胞增殖率、黑素含量，酪氨酸酶活性。结果：OPC对正常表皮黑素细胞的增殖和黑素合成无明显影响，但可呈浓度依赖性抑制紫外线辐射后的表皮黑素细胞的黑素合成，并能减轻紫外线辐射对细胞增殖的抑制作用。结论：天然寡聚体OPC对紫外线辐射的黑素细胞有光保护作用，它可明显抑制紫外线辐射后表皮黑素细胞的黑素合成，而对正常表皮黑素细胞的黑素合成无影响。

[关键词]黑素合成；原花青素；黑素细胞；表皮

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）06-0852-03

Lightening effect on ultraviolet-induced pigmentation of human melanocytes by proanthocyanidin-rich extract from grape seeds

MA Hui-jun1, ZI Shao-xia 2,LIU Wen1, XIE Yan-fei3,WANG Yi-xia1, ZHAO Guang1

(1.Department of Dermatology, Airforce General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100036, China.2.Department of Dermatology, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing 100036,China. 3.Department of Dermatology, Hospital of Ophthalmology and Otorhinolaryngology, Botou 062150,Hebei, China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of nature ologomers Proanthocyanidins on the pigment formation by normal human melanocytes and UVR-irradiated melanocytes.Methods Three different concentrations of Proanthocyanidins were incubated with normal human melanocytes and UV irradiated (10mJ/cm2 dose) human melanocytes for 72 h and then melanin content, reactivity of tyrasinase, rate of proliferation were measured.ResultsThere were no effects with melanogenesis and proliferation of normal melanocytes after expose of Proanthocyanidins.However, Proanthocyanidins can decrease the cellular melanin content and reactivity of tyrasinase of irradiated melanocytes with dose-dependent manner. Proanthocyanidins also can protecte proliferation of melanocytes after UV irradiation.ConclusionProanthocyanidins have sun-protection effects on melanocytes. It can inhibite melanogenesis and proliferation of epidermal melanocytes after UV irradiation.

Key words:melanogenesis;Proanthocyanidins;melanocytes; epidermal

原花青素（OPC）是葡萄籽的提取物，具有很强的抗氧化和清除自由基能力，其抗氧化强度比维生素C高10～40倍[1]。在欧美等国家，OPC素来享有“皮肤维生素”，“口服化妆品”等美誉，具有抗皱、美白之功效。但该寡聚体是否能对人表皮黑素细胞黑素合成有一定影响则未见报道。基于此，本文深入研究了OPC对正常表皮黑素细胞和紫外线照射后表皮黑素细胞黑素合成的影响，为探讨该天然寡聚体的美白作用提供理论依据。

1材料和方法

1.1 试剂和仪器：MCDB153培养基、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、12-O-十四烷佛波脂-13-醋酸酯(TPA)、分离酶(dispase)、霍乱毒素(CT)均为美国Sigma公司产品，噻唑蓝(MTT)为美国Amersco公司产品，原花青素粉由蓝科恒业医疗科技有限公司惠赠；进口胎牛血清（海克隆生物化学制品有限公司），25cm2塑料培养瓶、96孔培养板为美国Corning公司产品，GS-2004日光模拟器(北京澳华公司)、光辐照度计量仪SUV-5（中国计量科学院）、分光光度计（上海精密分析仪器有限公司）、Clinibio128c酶联免疫检测仪（澳大利亚Clinibio公司）

1.2方法

1.2.1 细胞培养：取健康青少年包皮环切手术后的包皮标本，去除皮下组织后剪成1cm×1m的小片，0.50%分离酶4℃放置12～16h，眼科镊轻轻分离表真皮，用0.25%的胰酶37 ℃消化表皮5～10min，用终浓度用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.05μg/ml CT， 50nmol/L TPA的MCDB153培养基于37℃、5% CO2条件下常规培养，取传2～3代纯化的表皮黑素细胞(经HMB45单抗免疫组化和Fontana-masson染色证实)，待生长至融合状态，以0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，台盼蓝染色法计数活细胞数，然后接种至25cm2塑料培养瓶，接种密度为105个细胞/cm2，液体量5ml/瓶。细胞接种24h后，根据实验分组对细胞进行干预处理，分别用于黑素含量和酪氨酸酶活性测定。

1.2.2 紫外线照射：GS-2004日光模拟器可发出连续紫外线光谱（约含25%UVA和75%UVB，几乎不含UVC，峰波长为312nm）以模拟自然紫外线照射, 紫外线照射剂量根据文献结果[2]选定为10mJ/cm2，照射时光源距培养板20cm，垂直照射，经光辐照度计量仪SUV-5测得照射强度为1.0mW/cm2，为避免培养基成分在光辐照下形成的光反应产物可能对细胞产生的影响，照射前用0.1M 灭菌的PBS轻轻冲洗细胞，照射后弃去PBS换为相应的细胞培养基。

1.2.3药物配制和实验分组：称取一定量的OPC融于二甲基亚砜溶液（DMSO）中制成50mg/ml的母液，-20℃保存，临用时用新鲜培养基调至终浓度。OPC的实验浓度分别设定为10、50、100μg/ml。实验分为紫外线辐射+OPC组、紫外线辐射组、OPC组；空白对照组（仅加入等量相应溶媒）；阳性对照组（紫外线辐射+20μg/ml维生素C）。每一处理组分别作用细胞72 h。

1.2.4 MTT法测定细胞增殖：取对数生长期的表皮黑素细胞，消化，计数，将细胞接种于96孔细胞培养板，接种密度为104/孔，液体量200μl/孔，过夜，待细胞贴壁，吸去培养液，用0.1M 灭菌PBS换液，对细胞分别进行紫外线照射、紫外线照射+OPC（10、50、100μg/ml 3个浓度）、单纯OPC处理（5、50、500μg/ml），添加相应的培养基后继续培养72 h，对照组不照光仅加入含等量溶媒的培养基。处理结束时，每孔加5 g/L MTT 20μl，继续置CO2孵箱培养4h，然后吸去培养液，每孔加入200μl DMSO，充分振摇培养板，用酶标仪测定每孔吸光度A490 nm值。

1.2.5 黑素含量测定：参照文献[3]的方法稍加改良，收获细胞，用血细胞计数器进行细胞计数（重复4次取均值），PBS 洗2次，加入200μl的双蒸水使细胞悬浮，加入1ml的乙醇、乙醚混合液（1:1）室温下放置15min,然后离心5min(3 000 r/min),沉淀加入1mol/LNaOH（含10%DMSO）1ml，置80℃ 30 min溶解黑素，加入4 ml双蒸水将NaOH稀释成0.2 mol/L，用分光光度计测定黑素的吸光度（A475nm）。黑素含量以（药物处理组A475/细胞数）/（空白对照组A475/细胞数）×100来表示。每一实验重复4次。

1.2.6 酪氨酸酶活性测定：参照文献[3]采用多巴氧化法，酪氨酸酶活性以（药物处理组A475值/细胞数）/（空白对照组A475值/细胞数）×100来表示。每一实验重复4次。

1.3统计学分析：所测数据均以x±s表示，采用非配对计量资料t检验，统计过程使用SPSS11.0统计软件完成。

2结果

2.1 OPC对表皮黑素细胞增殖和形态的影响：与空白对照组相比，OPC对体外培养的正常表皮黑素细胞增殖无明显影响，随着浓度的增加，细胞增殖略有下降但无统计学差异，细胞形态无变化；10mJ/cm2紫外线照射后细胞增殖有一定降低（P＜0.05），细胞形态表现为胞体增大，折光性减弱，树突增多、延长；紫外线照射后添加OPC组与照射组相比，细胞增殖有明显增加（P＜0.05），细胞胞体略小，折光性增强，树突无明显增多和延长，该效应以100μg/ml OPC组最为明显（图1、2）。

2.3 OPC对表皮黑素细胞黑素含量的影响：OPC对黑素细胞的黑素含量无明显影响，但可抑制紫外线辐射诱导的黑素合成能力增加，且以浓度依赖方式抑制黑素量的生成，较紫外线辐射组有显著差异（P＜0.05）。 20μg/ml维生素C也有一定程度抑制紫外线辐射后黑素细胞黑素合成增加的作用,但与紫外线辐射组比较无明显差异（P＜0.05）。

2.4 OPC对表皮黑素细胞酪氨酸酶活性的影响：与对照组相比，OPC对黑素细胞的酪氨酸酶活性无影响，10mJ/cm2紫外线辐射可明显增加细胞内酪氨酸酶活性。与紫外线辐射组比较，50μg/ml OPC和100μg/ml OPC组细胞酪氨酸酶活性明显降低（P＜0.05）20μg/ml维生素C组对紫外线辐射后细胞内酪氨酸酶活性无明显影响（P＞0.05）。

3讨论

OPC是一种大量存在于红酒和葡萄籽中的多酚类物质，据报道该寡聚体在水溶液和H2O2/NaOH/DMSO溶液中具有极强的抗氧化和清除自由基的能力[4]。Bagchi 等[5]用TPA处理的小鼠为模型进行研究，发现OPC较维生素C、维生素E以及维生素C、维生素E联合使用均具有更强的清除自由基和抗组织氧化和抗DNA损伤作用。Quevedo等[6]报道紫外线辐射诱导的无毛鼠皮肤中黑素细胞增殖和黑素合成增加作用可以被局部应用抗氧化剂如维生素C和维生素E所减弱。紫外线辐射可诱导体外培养的小鼠角质形成细胞DNA内8-OhdG（由ROS产生的一种DNA的光损伤产物）产生,同时诱导人皮肤中角质形成细胞增殖。因此，ROS在调节黑素细胞和角质形成细胞增殖和黑素细胞黑素合成方面发挥了重要的作用，而ROS产物的清除或抑制剂如抗氧化剂很可能具有减少黑素细胞黑素生成或阻止紫外线诱导的黑素合成增加的作用。基于此,我们对天然抗氧化剂OPC对人黑素细胞黑素合成的影响进行了研究。

既往研究[1]发现原花青素具有抑制B16鼠黑素瘤细胞黑素合成的作用，对黑素合成有直接的抑制作用。而Yamakoshi等[2]研究发现给豚鼠口服OPC可明显抑制紫外线照射区域皮肤的黑化，而对未照射区域的皮肤颜色无影响，提示OPC可能抑制了皮肤中被紫外线激活的黑素细胞的黑素合成和细胞增殖，而对正常状态黑素细胞的黑素合成无影响。为了更好的研究OPC对人黑素细胞功能的影响，本试验将OPC分别作用于正常培养的人表皮黑素细胞和紫外线辐射后的黑素细胞。发现：OPC对体外培养的正常黑素细胞黑素合成无直接影响，但可明显抑制经紫外线辐射后的黑素细胞的黑素合成，此作用明显强于另一种抗氧化剂维生素C。MTT法检测细胞增殖实验显示：OPC对细胞增殖无影响，但可改善由于紫外线辐射诱导的黑素细胞的增殖抑制作用。体外细胞酪氨酸酶活性测定结果也证实OPC可抑制紫外线辐射后黑素细胞内酪氨酸酶活性的增加，而OPC本身并无直接抑制人表皮黑素细胞酪氨酸酶活性的作用，上述结果提示我们OPC的美白效应可能主要来源于其对黑素细胞的光保护作用。

众所周知，一定剂量的紫外线辐射是诱导皮肤黑素合成的强烈的外源性刺激因素，它可通过直接或间接（诱导角质形成细胞释放多种细胞因子）作用来促进黑素细胞黑素合成和细胞增殖[2，7]。已经证实紫外线辐射可诱导皮肤活性氧自由基（ROS）形成和角质形成细胞产生一氧化氮(NO)，而这两种物质均具有很强的刺激黑素细胞黑素合成的作用[8]。因此我们推测OPC可能通过抑制上述一种或多种途径来发挥其美白作用，要想证实上述理论，尚需进一步的实验研究。

总之，OPC对人黑素细胞具有明显的光保护和光损伤修复作用，OPC对紫外线诱导的黑素合成有明显的抑制作用，其作用强于维生素C，具有良好的美白应用前景。

[参考文献]

[1]Shoji T, Masumoto S, Moriichi N, et al. Procyanidin Trimers to Pentamers Fractionated from Apple Inhibit Melanogenesis in B16 Mouse Melanoma Cells[J]. J Agric Food Chem,2005,53(15):6105-6111.

[2]Yamakoshi J,Otsuka F, Sano A, et al. Lightening effect on Ultraviolet-induced pigmentation of guinea pig skin by oral administration of a Proanthocyanidin-rich extract from grape seeds[J].Pigment Cell Res,2003,16(6):629-638.

[3]马慧军, 朱文元, 王大光. 胡椒碱等6种中药单体促进Cloudman S91黑素瘤细胞株黑素合成的研究[J]. 临床皮肤科杂志, 2004, 33(3): 145-147.

[4]Yamaguchi F, Yoshimura Y, Nakazawa H, et al. Free radical scavenging activity of grape seed extract and antioxidants by electron spin resonance spectrometry in an H2O2/NaOH/DMSO system[J]. J Agric Food Chem,1999,47(7):2544-2548.

[5]Bagchi D, Garg A, Krohn RL, et al. Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation, and peritoneal macrophage activation in mice[J]. Gen Pharmac 1998,30(5):771-776.

[6]Quevedo WC Jr, Holstein TJ, Dyckman J, et al. Inhibition of UVR-induced tanning and immunosuppression by topical applications of vitamin C and E to the skin of hairless (hr/hr) mice[J]. Pigment Cell Res, 2000,13(2):89-98.

[7] 金颂良，苏荣健，朱建伟,等.川芎嗪对中波紫外线又到黑素细胞黑素合成的影响[J].中国美容医学，2006,15（9）:1001-1003.

[8]Romero-Graillet C, Aberdam E, Clément M, et al. Ballotti R. Nitric oxide produced by ultraviolet-irradiated keratinocytes stimulates melanogenesis[J].J Clin Invest 1997,99(5):635-642.

[收稿日期]2008-02-26[修回日期]2008-05-05