时间：2022-09-28 05:59:45
[摘要] 该研究以高效液相色谱同时测定正天丸（钩藤、白芍、川芎、当归、防风等）中芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。试验中采用Insertil ODS-C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长230 nm。由试验结果可知，芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷在11.37～ 170.5，2.188～32.82，2.896～43.44，3.000～45.00 mg·L-1峰面积与进样量线性关系良好，r分别为0.999 9，0.999 9，1.000 0，1.000 0；回收率（n = 6）分别为102.3%（RSD 1.2%），99.71%（RSD 1.9%），101.2%（RSD 1.2%），99.40%（RSD 2.4%）。按所建方法对5批样品中上述4种成分的含量进行测定，结果均令人满意。该方法简便、准确，重复性好，可用于正天丸中芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量控制。
[关键词] 中成药；正天丸；芍药苷；阿魏酸；升麻素苷；5-O-甲基维斯阿米醇苷；HPLC
正天丸系由钩藤、白芍、川芎、当归、防风、地黄、白芷、羌活、桃仁、红花、细辛、独活、麻黄、附片、鸡血藤15味中药组成的复方制剂，具有疏风活血、养血平肝、通络止痛之功效，适用于多种类型的头痛[1]。本品为传统的水丸剂，目前对其功效成分的研究较少[2-3]，现行质量标准也仅测定白芍中芍药苷的含量，而且操作方法繁琐，一定程度上难以保证测定结果的准确可靠，从而影响该品种内在质量的有效评价。
处方中的君药川芎、臣药当归，具有活血行气、祛风止痛之功效；防风可解表祛风、胜湿止痛；白芍养血止痛[4]。上述诸药对正天丸之功效发挥均起重要作用，目前对上述各味药材均已进行了深入研究，明确其功效成分及药理活性[5-7]。本研究遵照复方制剂一测多评[8]的原则，在原质量标准的基础上，优化改进测定方法，采用HPLC同时测定正天丸中芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，方法准确、操作简便，为本品提供了更加全面有效的定量分析手段。
1 材料
Shimadzu 20-AD高效液相色谱仪（日本岛津，包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、2010色谱工作站）；XS 105电子分析天平（Mettler Toledo公司）；超声波清洗器（厦门李氏和达超声波设备有限公司）。
芍药苷、阿魏酸、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-201035，110773-200611，111522-201008，111523-201007；乙腈为色谱纯；甲醇、乙醇、磷酸为分析纯；水为超纯水。
正天丸，深圳三九药业股份有限公司生产，批号为1112020H，1111023H，1202018H，1112035H，1201023H；阴性样品为本实验室依据处方量自制。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 混合对照品溶液 分别取芍药苷、升麻素苷、阿魏酸、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，精密称定，用甲醇稀释成每1 mL分别含60，15，10，15 μg的混合对照品溶液，混匀，即得。
2.1.2 供试品溶液 将样品研细，取1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇15 mL，称定质量，超声处理30 min（500 W，33 kHz），取出，冷却，用稀乙醇补足减失的质量，滤过，取续滤液即得。
2.1.3 阴性样品溶液 依处方量分别制备缺白芍、防风、当归、川芎的阴性样品，按2.1.2项下方法制成阴性样品溶液，备用。
2.2 色谱条件及系统适用性考察
采用Insertil ODS-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～20 min，11%A，20～40 min，11%～20%A，40～45 min，20%A，45～50 min，20%～90%A，50～60 min，90%A，流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长230 nm；进样量10 μL。在上述色谱条件下，对照品、样品、阴性样品色谱图见图1。样品与对照品在相同保留时间内有色谱峰，而阴性样品无色谱峰，说明样品中其他成分对待测成分无干扰，且4个成分与相邻色谱峰均能达到基线分离，分离度均大于1.5。
2.3 线性关系的考察
取芍药苷对照品5.89 mg，用甲醇溶解并稀释至10 mL，作为对照品溶液1。另取阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品5.47，7.71，7.50 mg，用甲醇溶解并稀释至10 mL，作为对照品溶液2。分别精密吸取配好的对照品溶液1和对照品溶液2各0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。取各混合对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按2.2项下色谱条件洗脱，以各对照品峰面积Y对其浓度X（mg·L-1）进行线性回归，得回归方程，见表1。
2.4 精密度试验
取样品（批号1202018H），按2.1.2项下方法制备成供试品溶液，按2.2项下条件重复进样5次，测定峰面积。芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD（n=5）分别为1.2%，1.3%，1.2%，1.1%，表明精密度良好。
2.5 稳定性试验
取同一样品溶液分别在0，4，8，12，16，24 h进样测定，芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD（n=6）分别为1.0%，1.3%，1.8%，0.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.6 重复性试验
取样品6份，每份约1 g，精密称定，按上述方法制备成供试品溶液，进样测定，芍药苷、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均质量分数分别为0.97，0.15，0.17，0.24 mg·g-1，RSD（n=6）分别为1.7%，2.0%，1.8%，2.8%。
2.7 加样回收率试验
取已知含量的样品（批号1202018H）6份，每份约0.8 g，精密称定，精密加入相同量的混合对照品溶液，按上述条件测定并计算回收率，结果见表2。结果表明，该法准确度良好，测定结果真实、可靠。
2.8 样品含量测定
取样品5批，每批2份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定，记录峰面积，并按外标法计算含量，结果见表3。
3 讨论
3.1 测定波长的选择
待测4种成分最大吸收波长各不相同，经DAD检测器在紫外190～400 nm扫描，结果显示，在230 nm波长下，4种成分均有较好吸收，且结果稳定。
3.2 流动相的选择
通过查阅相关文献[9-12]，对不同的流动相系统乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸溶液，乙腈-0.1%乙酸溶液，甲醇-0.05%磷酸溶液等进行比较，结果发现当用乙腈-水为流动相时，待测组分峰形较差，乙腈-0.1%乙酸溶液为流动相时，在230 nm波长下对基线干扰较大，而甲醇-0.05%磷酸溶液为流动相分析时间太长。因此，选择乙腈-0.05%磷酸溶液作为流动相，按2.2项下的洗脱程序进行分析，各成分色谱峰峰形良好，分离度均大于1.5。
3.3 提取溶剂的选择
本试验分别用甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、稀乙醇作为提取溶剂，样品超声30 min后测定，结果发现待测成分经稀乙醇提取后，测得含量最高，综合考虑后决定以稀乙醇作为提取溶剂。
3.4 提取方法的选择
试验过程中分别考察了超声提取30 min、水浴回流1 h对样品含量的影响，结果发现2种提取方法所测4种待测组分的含量基本接近，鉴于超声提取方便快捷，故选用超声处理方式。同时对超声时间20，30，40，60 min进行考察，结果发现不同超声时间对测定结果无显著影响，为与原质量标准含量测定方法相比较，故选定超声处理30 min。
3.5 含量限度的制定
根据2010年版《中国药典》一部的规定，白芍饮片中芍药苷的质量分数不得少于1.2%，当归中阿魏酸的质量分数不得少于0.050%，川芎中阿魏酸的质量分数不得少于0.10%，防风中升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量分数不得少于0.24%。由于正天丸为药材原粉入药，白芍、当归、川芎、防风在处方中所占的比例分别为6.1%，5.1%，9.1%，5.1%，按有效成分转移率90%计，根据药材投料比例及理论含量计算，正天丸中含芍药苷应不少于0.66 mg·g-1，阿魏酸应不少于0.11 mg·g-1，升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷应不少于0.11 mg·g-1。
3.6 小结
近几年来，对中成药制剂的质量控制已经取得了较大的进展，不足之处是单一指标不足以代表处方的整体质量水平。因此，制定多成分、多指标的含量标准，可从多方面控制中药制剂的产品质量，使其疗效可靠、稳定。本试验采用HPLC同时测定正天丸中4种指标性成分的含量，为该制剂综合质量的评价提供准确、快捷的定量分析方法，进一步提高了质量控制标准。
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Simultaneous determination of paeoniflorin， ferulic acid， prim-O-glucosylcimifugin and 4′-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol in Zhengtian pills by HPLC
HUANG Lan*， CHEN Hui-ling， LI Ling-ling
（Xiamen Institute for Drugs Control， Xiamen 361012， China）
[Abstract] To simultaneously determine paeoniflorin， ferulic acid， prim-O-glucosylcimifugin and 4′-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol in Zhengtian pills. In the test， Insertil ODS-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was adopted， with acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was 230 nm. According to the results of the test， paeoniflorin， ferulic acid， prim-O-glucosylcimifugin and 4′-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol showed good linear relations between peak areas and sample sizes in 11.37-170.5， 2.188-32.82， 2.896-43.44， and 3.000-45.00 mg·L-1 （r=0.999 9， 0.999 9， 1.000 0， 1.000 0），respectively. The average recoveries （n=6） were 102.3% （RSD 1.2%），99.71% （RSD 1.9%）， 101.2% （RSD 1.2%）， and 99.40% （RSD 2.4%）， respectively. The above four components were determined in five batches of samples by using the established method， with satisfactory results. The method was so simple， accurate and highly reproducible that it could be used for quality control of the four components in Zhengtian pills.
[Key words] Chinese patent medicine； Zhengtian pills； paeoniflorin； ferulic acid； prim-O-glucosylcimifugin ； 4′-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol； HPLC
doi：10.4268/cjcmm20131316