海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区磷酸化p38 MAPK的蛋白表达的影响

【摘要】 目的：观察海洛因暴露对小鼠成瘾和学习记忆相关脑区的磷酸化p38 mapk（p?p38）表达的影响，探讨p38 mapk细胞信号转导通路是否参与了发育早期海洛因暴露引起子代脑发育损伤的分子机制. 方法： 于胚胎鼠龄9～18 d时给孕鼠皮下注射海洛因10 mg/(kg·d)，建立子宫内海洛因暴露的小鼠模型. 按出生前处理将小鼠分为海洛因和盐水组. 蛋白免疫印迹检测两组小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区p?p38的表达改变. 结果： 与盐水组相比，海洛因组小鼠的p?p38蛋白表达在前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核4个脑区均有明显增加( p< 0.05). 结论： 海洛因暴露可引起小鼠前额叶皮层、海马、伏核、杏仁核脑区的p?p38 mapk蛋白表达上调，提示p38 mapk信号通路可能参与了海洛因损伤小鼠神经发育的分子机制.

【关键词】 海洛因；p38丝裂原活化蛋白激酶；前额叶皮层；海马；伏核；杏仁核

0引言

近年来，女性滥用者增多，且大多属于育龄期妇女［1-2］. 研究表明，子宫内海洛因暴露不但可引起新生儿宫内窘迫和发育迟缓，还可导致子代成年后长期的认知行为缺陷和社会行为障碍［3-4］，但其细胞、分子机制未完全阐明. p38是mapk(mitogen?acti vated protein kinase) 超家族的重要成员之一，属于应激活化激酶，p38 mapk不但与其他信号传递途径共同介导细胞应激诱发的基因表达和酶活性的改变，还在细胞凋亡、细胞因子的合成释放、细胞骨架重排等机制中发挥重要作用［5-6］. 本研究旨在探讨p38 mapk 通路是否参与了海洛因导致后代神经、行为异常的机制.

1材料和方法

1.1材料标准品海洛因（heroin），学名二乙酰吗啡，纯度98.5%，由中国药品生物制品检定所（国家麻醉品实验室）提供，批号171206-200614. 兔抗鼠磷酸化p38 mapk mab，山羊抗β?actin pab （美国cell signalling 公司）；辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗兔或山羊二抗（博奥森公司）；ecl化学发光试剂盒、pvdf 膜及hyperfilm 胶片（德国merck 公司）；蛋白质提取及浓度测定试剂盒（美国bio?rad 公司）. fs?600超声波粉碎仪(上海生析超声仪器有限公司)；离心机（德国eppendorf公司）；电泳仪（德国whatman biometra公司）；紫外成像扫描仪及分析系统（美国bio?rad公司）.

1.2方法

1.2.1动物分组及模型建立选健康活泼balb/c 小鼠60只(第四军医大学实验动物中心)，雌雄各半，2 mo龄，体质量(25±5)g. 自由饮食饮水，昼夜12 h交替光照，室温25℃，湿度60% 左右. 每日21∶00 雌雄合笼，次日晨查精栓或阴道涂片，以精栓或阴道涂片查到做为受精标志，记为e0d. 将体质量相近的实验动物随机分为海洛因组和盐水组. 从e0～e8 各组动物自由进食, e9～e18 d，盐水组于21∶00在小鼠大腿外侧皮下注射生理盐水20 ml/（kg·d），1/d，海洛因组组给予海洛因10 mg/（kg·d） 注射，1/d，将药物溶于生理盐水中，0.5 g/l. 子代分组同亲代孕鼠.

1.2.2蛋白印迹实验仔鼠30 d龄时在各脑区取材，0.16 mol/l戊巴比妥钠腹腔麻醉，速断头、开颅、分离各脑区，即刻入液氮，冻存管分装，-80℃贮存. 用时加入4℃胞质蛋白提取液裂解，20∶1 加入蛋白酶抑制剂pmsf，高速分散器组织匀浆，冰浴1 h，12000 g 4℃离心10 min，沉淀加入4℃预冷白提取液，震荡混匀，冰浴1 h，再12000 g 4℃离心30 min，取上清为白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量，取上清加等体积2×sds 样品缓冲液，煮沸5 min 使蛋白变性. 取50 μg待测蛋白加入等体积2×上样缓冲液煮沸5 min，行sds?page 电泳，蛋白半干转至pvdf膜. 100 v 恒压转移2 h后，将pvdf 膜在含5%脱脂奶粉的tbst中室温下封闭1 h，与1∶1000一抗p?p38 mapk 兔多抗4℃孵育过夜，pbst 缓冲液洗膜3次，每次10 min；随后加入羊抗兔 igg?hrp 37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ecl化学发光试剂显影，胶片曝光，uvp 凝胶成像系统扫描目的条带，labworks 软件测量各阳性条带的光密度，将p?p38 mapk阳性条带与相应的β?actin 条带吸光度比值作为其蛋白的相对表达量.

统计学处理：所有数据均采用spss12.0进行处理，多样本均数比较采用单因素方差分析.

2结果

分析各组间相应蛋白带的平均吸光度值，以β?actin作内参蛋白，调整后进行半定量分析. 与盐水组相比，海洛因组动物的前额叶皮层、海马、伏核和杏仁核4个脑区组织的p38 mapk磷酸化蛋白表达均明显增加（p< 0.05，图1，2）.

3讨论

mapk信号系统作为真核细胞内各种信息传递的最后通路和共同通路，能够将细胞外的各种刺激信息转移到细胞核内，是神经细胞发生一系列可塑性变化的分子基础. p38 mapk 多见于促炎和促凋亡的途径中，它在细胞分化、凋亡、迁移和增殖等基本生理过程中也发挥着不可忽视的作用［5］，许多细胞外刺激如应激刺激、炎性细胞因子、细胞因子、脂多糖、生长因子等通过细胞内信号转导通路激活p38 mapk，进而磷酸化激活 mapk apkinase?2 等，并最终激活atf?2，max 和mef2 等转录因子而产生生物学效应［6］，但其具体调制及与其他信号通路之间的关系尚未明了.

海洛因暴露导致的行为异常与海洛因作用的时间、时程、剂量和给药方式等有密切关系，作用方式不同可导致的行为学损伤不完全相同. 我们采用的模型已报道动物有成年后迷宫学习记忆行为缺陷［7］，海马胆碱能系统及pkc 细胞学定位的改变［8］. 海洛因可迅速通过胎盘和血脑屏障，直接作用于发育中的神经细胞，导致子代成年后的神经行为损伤，但其细胞、分子机制未完全阐明. 我们的结果显示，发育早期海洛因暴露，上调了小鼠前额叶皮层，海马，伏核，杏仁核脑区中p38 mapk 磷酸化蛋白的表达，提示在这些与成瘾和学习记忆相关的脑区里，存在着p38 mapk 信号通路可能参与的生理病理学过程的改变，提示海洛因对子代动物成年后神经行为异常的长期影响，至少是部分源于海洛因在动物的神经系统发育早期，作用于神经行为相关的靶区，使该靶区的神经活动异常或作用于相关基因，使海洛因的致畸作用持续到生后，如海马损伤导致海马依赖的空间学习记忆损伤.

p38 mapk在疾病发展的不同阶段，发挥的作用有所不同. 在细胞应激反应或炎症反应的早期，p38 上调发挥脑保护作用，但随着反应进程的加深，上调的p38 可以通过加强细胞的炎性反应，介导其他胞外信号引起的炎性细胞因子或炎性产物的表达和释放，以介导凋亡性细胞死亡的方式损伤神经细胞［6, 9］. p38 蛋白在成瘾和学习记忆相关脑区的持续表达上调，是损伤神经发育，或是激发了损伤后的神经代偿机制，需要进一步研究.

我们结果的提示，p38 mapk 通路可能参与了海洛因对胚胎脑发育的毒性作用，进而影响动物成年后的行为，为进一步探讨子代神经行为的损伤机制及后期临床干预中靶蛋白的确定提供了有意义的资料.

【参考文献】

［1］ 杨凤瑞，高伟，顾迎莉，等. 2006年中国禁毒报告［r］. 国家禁毒委员会报告，2007：2-5.

［2］ nora dv. nida research report ? heroin abuse and addiction: nih publication no. 05?4165,［r］. nida 2005:1-2.

［3］ walhovd kb, moe v, slinning k, et al. volumetric cerebral characteristics of children exposed to opiates and other substances in utero ［j］. neuroimage，2007, 36 (4): 1331-1344.

［4］ yanai j, ben?shaanan tl, haimovitch h, et al. mechanism?based approaches for the reversal of drug neurobehavioral teratogenicity ［j］. ann n y acad sci, 2006, 1074: 659-671.

［5］ johnson gl, lapadat r. mitogen?activated protein kinase pathways mediated by erk, jnk, and p38 protein kinases ［j］. science, 2002, 298 (5600):1911-1912.

［6］ kumar s, boehm j, lee jc, et al. p38 map kinases: key signalling molecules as therapeutic targets for inflammatory diseases ［j］. nat rev drug discov, 2003, 2(9): 717-726.

［7］ huleihel r, yanai j. disruption of the development of cholinergic?induced translocation/activation of pkc isoforms after prenatal heroin exposure ［j］. brain res bull， 2006, 31; 69(2): 174-181.

［8］ yanai j, steingart ra, snapir n, et al. the relationship between neural alterations and behavioral deficits after prenatal exposure to heroin ［j］. ann n y acad sci, 2000, 914: 402-411.

［9］ peifer c, wagner g, laufer s. new approaches to the treatment of inflammatory disorders small molecule inhibitors of p38 map kinase ［j］. curr top med chem, 2006，6(2): 113-149.