溶藻细菌H5对汉斯冠盘藻的溶藻特性研究

摘要：为了进一步研究溶藻细菌H5的溶藻特性，采用透析、乙醇沉淀、有机溶剂萃取、酸碱稳定性分析等方法探讨了H5溶藻活性物质的特性。结果表明，H5的溶藻活性物质的相对分子质量在3.5～7.0 ku之间，不能用乙醇沉淀法完全分离，具有较好的亲水性，在pH 4～7的酸性范围内溶藻能力较强。H5无菌滤液使汉斯冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）藻细胞丙二醛含量显著上升，SOD活力在处理0～196 h内急剧上升，随后下降，由此推测该活性物质能使藻细胞发生膜脂过氧化，从而破坏了膜的完整性。

关键词：溶藻细菌；溶藻活性物质；溶藻特性；汉斯冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3011-04

富营养化已成为众多水体普遍存在的环境问题。随着经济的快速发展，日益增加的工农业污染连同大型水利建设可能使我国的许多河流的富营养化水平进一步升高。自20世纪90年代以来汉江中下游及其支流多次暴发早春硅藻水华[1]；三峡工程建成蓄水后不久，香溪河、大宁河等主要支流库湾每年春季暴发硅藻、甲藻水华[2]。水华发生时水色呈现褐红色、或深或浅的酱油色，并伴有腥味，严重影响了当地景观和生态系统服务功能[3]。面对日益严重的水华问题， 在物理、化学和其他生物方法除藻效果不甚理想的情况下，研究利用溶藻细菌防治水华和赤潮成为一个新的方向，引起了国内外学者的广泛关注。

溶藻细菌是水华或赤潮发生时伴随的一类细菌，是一类以直接或间接方式抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞细菌的统称[4]。不少研究者认为水华和赤潮的消亡都可能与溶藻细菌的溶藻功能有关[4，5]。近年来，国内外对溶藻细菌的研究主要集中在溶藻细菌的分离、藻菌的相互作用和胞外分泌物对藻细胞的作用[5，6]，但对于胞外分泌物的性质和溶藻作用机制缺乏深入研究。大多数溶藻细菌的研究都是针对蓝藻水华[5-7]，而对于控制硅藻水华的溶藻细菌的研究则鲜见报道。

三峡库区生态环境教育部工程研究中心水污染控制实验室前期从三峡水库香溪河库湾爆发硅藻水华的水体中筛选出1株溶藻细菌H5，并鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis），其溶藻方式是间接溶藻，即分泌溶藻物质于胞外，抑制藻类的生长。本试验通过进一步研究溶藻细菌 H5对汉斯冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）的溶藻方式、胞外活性物质的基本化学性质和作用，以期为研制高效的生物化学除藻剂提供基础。

1 材料与方法

1.1 藻种来源及培养

试验所用藻种为汉斯冠盘藻，藻种经活化后，在（15±1）℃、光照度为2 500 lx、光暗周期比12 h∶12 h的培养条件下，采用DM液体培养基[8]， 置于恒温光照生化培养箱中静置培养，间或振荡。藻种的接种及传代过程中均严格按照无菌操作规则进行。采用血球计数板对汉斯冠盘藻细胞浓度进行计数。

1.2 细菌培养基

细菌培养用LB培养基，分离、纯化和保种采用牛肉膏蛋白胨固体培养基[9]。

1.3 溶藻细菌H5无菌滤液的制备

取50 mL 溶藻细菌H5种子液加入到 450 mL LB培养基中，于25 ℃、160 r/min振荡培养2 d后，以20 000 g 离心30 min 收集上清液，上清液用0.22 μm细菌滤器过滤，并通过固体牛肉膏蛋白胨平板进行无菌检验，得到H5无菌滤液。

1.4 溶藻能力的分析

溶藻能力的分析采用Kang等[10]的方法。无菌滤液、细菌培养液等试验组样品按照1∶100的比例接入100 mL指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，对照组则加入相同体积的新灭菌的LB培养基到指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，4 d后测定各组汉斯冠盘藻浓度，然后计算杀藻率，杀藻率计算公式为：杀藻率=（1-试验组藻浓度/对照组藻浓度）× 100%。

1.5 溶藻活性物质特性分析

1.5.1 活性物质相对分子质量大小判定 活性物质相对分子质量大小的分析采用李燕等[11]的方法，略作修改。将500 mL H5无菌滤液经65 ℃旋转蒸发至50 mL，分别取10 mL装入截留相对分子质量为3.5 ku和7.0 ku的透析袋中，将透析袋放入蒸馏水中，以20 ℃、100 r/min振荡透析48 h，透析期间每隔12 h 更换1 次蒸馏水。透析完成后，收集袋内透析样并用无菌水定容至 10 mL，将此透析样经0.22 μm滤膜过滤后按体积比1∶100 接入100 mL 指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，4 d后测定杀藻率。

1.5.2 活性物质乙醇沉淀分析 活性物质乙醇沉淀分析采用李蔷等[12]的方法，略作修改。将H5无菌滤液加入无水乙醇于4 ℃下静置1 h，以4 000 r/min离心后分别收集上清液和沉淀。将收集的上清液经65 ℃真空旋转蒸发浓缩后，再次加入无水乙醇沉淀，将上述步骤再重复1次。将收集的上清液再经65 ℃真空旋转蒸发浓缩后，用无菌水定容至50 mL，此部分为乙醇沉淀后获得的上清液部分；将收集的沉淀用少量无菌水溶解并定容至50 mL，此部分为乙醇沉淀获得的沉淀部分。将上清液组、沉淀组、H5无菌滤液经0.22 μm 滤膜过滤后按体积比1∶100接入100 mL指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，4 d后测定杀藻率。

1.5.3 活性物质极性分析 活性物质极性分析采用文献[11]的方法。取3份50 mL的2倍无菌浓缩液，每份分别用100 mL石油醚、四氯化碳、乙酸乙酯反复两次进行过夜静置萃取，分别收集水相和有机相。水相经旋转蒸发仪65 ℃真空蒸发掉残留的有机溶剂；有机相经65 ℃真空蒸发至干后，用少量蒸馏水溶解残留固体。两相分别经0.22 μm滤膜过滤后，用无菌水定容至相同体积，比较两相的溶藻效果。

1.5.4 活性物质酸碱稳定性分析 活性物质酸碱稳定性分析采用文献[12]的方法，H5无菌滤液用氢氧化钠或盐酸溶液分别调节pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，1 h 后调回原pH（7.2），经过0.22 μm滤膜过滤后按体积比1∶100接入100 mL 指数生长中期的汉斯冠盘藻藻液中，4 d 后测定杀藻率。

1.6 丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定

按照牛丹丹等[13]的方法测定MDA含量和SOD活性。即取一定量的汉斯冠盘藻藻液，在4 ℃下8 000 r/min离心收集藻细胞，加入少量磷酸缓冲液（pH 7.8）和石英砂在冰浴中研磨，匀浆液以4 ℃、8 000 r/min离心20 min，收集上清液，立即使用或者保存在-70 ℃下备用，MDA含量的测定采用TBA法。

2 结果与分析

2.1 H5溶藻活性物质的特性

2.1.1 活性物质的相对分子质量大小 采用透析的方法分析溶藻活性物质相对分子质量的大小，结果见图1。由图1可知，10倍无菌浓缩液经截留相对分子质量为7.0 ku的透析袋透析后，透析样无溶藻效果；经截留相对分子质量为3.5 ku 的透析袋透析后，透析液杀藻率与无菌浓缩滤液无显著性差异（P>0.05）。因此，H5的溶藻活性物质的相对分子质量在3.5～7.0 ku之间。

2.1.2 活性物质的乙醇沉淀分析结果 H5的无菌浓缩液经乙醇沉淀处理后，上清液组和沉淀组均有一定的溶藻效果，上清液组的溶藻效果明显高于沉淀组（图2）。而不管是上清液组还是沉淀组，其溶藻效果均不及原无菌浓缩液。在水溶液中，乙醇会使许多蛋白质、核酸、多糖等多种物质沉淀下来[14]，H5溶藻细菌的溶藻活性物质不排除有上述物质的可能，但是起主要溶藻作用的物质不是上述物质。

2.1.3 活性物质的极性 H5的无菌浓缩液经石油醚、四氯化碳和乙酸乙酯萃取后，水相都有较好的溶藻效果，有机相都无明显的溶藻效果（图3）。在上述 3 种有机溶剂萃取后所得的水相中，又以石油醚水相溶藻效果最好，杀藻率达到85.2%；四氯化碳次之；乙酸乙酯水相溶藻效果最差，杀藻率仅为56.1%，表明乙酸乙酯能萃取到少量的溶藻活性物质，能抑制藻的生长，但抑制作用不强。据此判断活性物质为强亲水性物质。

3 种有机溶剂的极性由小到大为石油醚、四氯化碳、乙酸乙酯，乙酸乙酯为中等极性的有机溶剂， 3种有机溶剂萃取到的脂溶性成分几乎没有溶藻活性，也表明溶藻细菌H5的活性物质为强亲水性物质。

2.1.4 活性物质的酸碱稳定性 H5的无菌滤液在pH调至4.0～7.0，1 h 后再调回原值7.2，其代谢产物的溶藻活性不受影响，其杀藻率为86.4%～92.7%（图4）。当无菌滤液在pH为3.0或pH≥8.0，1 h后再调回原pH，代谢产物的溶藻活性大大降低，以致丧失。

2.2 H5无菌滤液对汉斯冠盘藻MDA含量和SOD活性的影响

H5无菌滤液对汉斯冠盘藻藻细胞MDA含量和SOD活性的影响见图5。加入H5无菌滤液8 h后，藻细胞MDA含量增加40%，随着时间的延长，MDA含量增加愈显著，处理72、196、264 h后，MDA含量分别增加197%、496%和580%；加入无菌滤液8 h ，藻细胞SOD活力增加40%，处理72 h后SOD活力增加80%，处理196 h后SOD活力达到最大值，随后又急剧下降。

3 小结与讨论

研究结果表明，H5的溶藻活性物质的相对分子质量在3.5～7.0 ku之间。Nobuyuki 等[15]发现1株蜡状芽孢杆菌对铜绿微囊藻的溶藻活性物质相对分子质量在2.0 ku以下。李燕等[11]研究表明，蜡状芽孢杆菌L8和短小芽孢杆菌L18产生的溶藻活性物质对水华鱼腥藻有溶藻作用，其溶藻活性物质的相对分子质量在3.5～7.0 ku之间。溶藻细菌产生的溶藻活性物质中既有亲脂性的、也有亲水性的，还有的同时具有亲脂和亲水性[16]。本研究中溶藻细菌H5产生的溶藻活性物质具有较强的亲水性。Nobuyuki等[15]发现蜡状芽孢杆菌N-14对铜绿微囊藻的溶藻活性物质在碱性范围内非常稳定，而在酸性范围内稳定性急剧下降。李蔷等[12]报道1株芽孢杆菌B1的无菌滤液溶藻的最适pH为9左右。本研究中溶藻细菌H5产生的溶藻活性物质在酸性范围内稳定，而在碱性范围内稳定性下降，表明本研究中的溶藻活性物质可能是一种新的溶藻剂。

MDA含量是生物细胞膜脂过氧化的重要指标，表明细胞膜完整性被破坏的程度[17]。本研究结果表明，在0～264 h内MDA的含量始终处于增加的状态，说明随着无菌滤液处理时间的延长，藻细胞膜脂过氧化不断加深，藻细胞的完整性被破坏的程度不断加重，从而达到溶藻目的。SOD在生物抗氧化酶类中处于核心地位，它是第一个参与清除活性氧的保护酶[18]。藻细胞SOD活性在0～196 h内不断增强，表明藻细胞受到溶藻细菌的胁迫后，保护性反应不断升高，到达峰值后藻细胞受损，其保护性反应又不断下降。

综上所述，溶藻细菌H5溶藻活性物质具有分子量小、亲水性强、能够破坏藻细胞膜的完整性、在较广的pH范围内活性稳定等这些特性，都有利于其发挥溶藻作用。

参考文献：

[1] 殷大聪，郑凌凌，宋立荣.汉江中下游早春冠盘藻（Stephanodiscus hantzschii）水华暴发过程及其成因初探[J]. 长江流域资源与环境，2011，20（4）：451-458.

[2] 诸葛亦斯，欧阳丽，纪道斌，等.三峡水库香溪河库湾水华生消的数值模拟分析[J].中国农村水利水电，2009（5）：18-22.

[3] 杨 敏，毕永红，胡建林，等.三峡水库香溪河库湾春季水华期间浮游植物昼夜垂直分布与迁移[J].湖泊科学，2011，23（3）：375-382.

[4] JUNG S W， KIM B H， KATANO T， et al. Pseudomonas fluorescens HYK0210-SK09 offers species-specific biological control of winter algal blooms caused by freshwater diatom Stephanodiscus hantzschii[J]. J Appl Microbiol，2008，105（1）：186-195.

[5] 叶姜瑜，钟以蓉，俞 岚，等.一株水华鱼腥藻溶藻菌的分离鉴定及菌藻关系初探[J].安徽农业科学，2011，39（29）：18121-18124.

[6] LEE S， KATO J， TAKIGUCHI N， et al. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. strain A28[J]. Appl Environ Microbiol，2000，66（10）：4334-4339.

[7] SHI S Y， LIU Y D， SUN Y W， et al. Lysis of Aphanizomenon flos-aquae （Cyanobacterium） by a bacterium Bacillus cereus[J]. Biol Control，2006，39（3）：345-351.

[8] BEAKES G， CANTER H M， JAWORSKI G H M， et al. Zoospores ultrastructure of Zygorhizidium affluens Canter and Z. planktonicum Canter， two hytrids parasitizing the diatom Asterionella Formosa Hassall[J]. Can J Bot，1988，66：1054-1067.

[9] 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学试验[M]. 第三版.北京：高等教育出版社，2002.

[10] KANG Y H，KIM J D， KIM B H， et al. Isolation and characterization of a bio-agent antagonistic to diatom， Stephanodiscus hantzschii[J]. J Appl Microbiol，2005，98（5）：1030-1038.

[11] 李 燕，潘伟斌，杨丽丽.三株溶藻细菌胞外溶藻活性物质若干分离特性的研究[J].微生物学通报，2008，35（2）：171-177.

[12] 李 蔷，赵 玲，尹平河.芽孢杆菌B1胞外活性物质对球形棕囊藻的溶藻特性研究[J].环境科学，2012，33（3）：838-843.

[13] 牛丹丹，郑青松，刘兆普，等.溶藻细菌YZ对铜绿微囊藻的溶藻特性研究[J].中国环境科学，2011，31（2）：321-326.

[14] 夏其昌，曾 嵘.蛋白质化学与蛋白质组学[M].北京：科学出版社，2004.

[15] NOBUYUKI N， KAZUNORI N， NORIO S， et al. A novel cyanobacteriolytic bacterium， Bacillus cereus， isolated from a Eutrophic Lake[J]. J Biosci Bioeng，2003，95（2）：179-184.

[16] WANG X L， GONG L Y， LIANG S K. Algicidal activity of rhamnolipid biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa[J]. Harmful Algae，2005，4（2）：433-443.

[17] SHI S Y， TANG D S， LIU Y D. Effects of an algicidal bacterium Pseudomomas mendocina on the growth and antioxidant system of Aphanizomenon flos-aquae[J]. Curr Microbiol， 2009，59（2）：107-112.

[18] 史顺玉.溶藻细菌对藻类的生理生态效应及作用机理研究[D].武汉：中国科学院水生生物研究所，2006.