西瓜离体培养研究进展

摘 要：本文综述了西瓜不定芽诱导、体细胞胚胎发生、花药培养、原生质体培养和体细胞杂交、体细胞无性系变异及转基因等方面取得的研究进展，并对西瓜离体培养、遗传转化与育种的前景作了展望。

关键词：西瓜；离体培养

西瓜（Citrullus lanatus），因其香甜的口味倍受许多人喜爱。本文从不定芽发生、体细胞胚形成、花药培养、原生质体培养和体细胞杂交、体细胞无性系变异与离体筛选以及转基因等方面系统地介绍了西瓜的组织与细胞培养研究的进展，并对其发展趋势以及在遗传育种中的应用前景作了展望。

1 不定芽诱导

不定芽的发生是完成从细胞到植株的最关键途径和步骤。在离体培养中，西瓜未成熟子叶不定芽分化频率可达100%。一般认为，子叶是比较理想的外植体。据报道，当胚胎在黑暗条件下发芽可以提高子叶的器官再生能力[1]，子叶的末端具有最高的再生频率[2]。已有报导从不成熟的子叶可以再生不定芽[3]。从0.5～1cm胚轴可得到不定芽，但是再生频率很低[4]。所有有关西瓜再生不定芽的报道都阐明了所使用的培养基为MS培养基[5-7]。最佳不定芽再生条件是加入1～2 mg/l BA作为唯一的生长调节剂[5-7]。据报道，当把西瓜子叶在固体培养基培养时再生能力最高[6-7]。

2 体细胞胚的发生

通过体细胞胚形成得到再生植株是有利的，诱导体细胞胚胎发生通常是以子叶作为外植体。从授粉后结实14～28天的西瓜以不成熟种子的子叶为外植体也可得到胚状体。以体细胞胚途径获得的再生植株，自花授粉后产生的不成熟种子为外植体，可以提高胚胎的形成能力。然而再生频率很低，由于胚胎的各种异常，对于大多数发芽的胚，在形成子叶之前都会出现上述情况。

除非再生频率得到提高， 对于西瓜来说，通过体细胞胚的植株微繁是不适用的。 同再生不定芽相比，体细胞胚的再生频率很低，并且从不成熟种子得到外植体的种种限制， 通过体细胞胚得到再生植株不切实际。

3 花药培养

利用花粉小孢子及未受房进行离体培养， 可以再生出单倍体植株。 经人工加倍后， 得到完全纯合的双单倍体。 这样可以大大缩短选择及纯化的过程和时间， 对植物遗传育种具有重要的理论和实际意义。

从20个世纪80年代初，世界上就有不少科研单位相继开展了西瓜和甜瓜花药培养的研究。我国在1982年，由薛光荣等[8]在“琼酥”和“周至红”2个西瓜品种的花药进行了培养，获得了单倍体植株，但其愈伤组织的诱导率仅为0.5%，育种上难以利用。以后魏瑛[9]和袁万良[10]也对西瓜花药培养进行了研究，但进展不大：花药培养中小孢子的发育途径，大都是经过愈伤组织，而没有形成胚状体；尽管愈伤组织诱导率得到了提高，但其分化和再生能力却不明确，愈伤组织中细胞的倍性变化复杂。花培育种既可充分利用植物的种质资源，又可获得性状的多样性。但是瓜类花药（小孢子）培养难度较大，其诱导率太低，仅为千分之几，难以应用于育种实践。

4 原生质体培养和体细胞杂交

原生质体不仅和完整的细胞一样具育全能性， 而且还因除去了细胞壁这一天然屏障， 能比较容易地摄取外源遗传物质如DNA、 染色体、 病毒、 细胞器等， 因而为高等植物在细胞水平与分子水平的遗传操作提供了理想的实验体系。 因此， 原生质体培养和体细胞杂交在改良西瓜遗传性状方面有着广阔的应用前景。

在原生质体培养的基础上，研究者进行了种间原生质体融合的试验，以克服远缘杂交的难题，在创造新材料方面开辟了一条新的途径。通过原生质体融合的方法，可实现亲缘关系较远物种间的基因重组，不仅克服了自然条件下有性杂交的局限，而且可以在不确切了解遗传背景的情况下，转移或重组单基因尤其是多基因控制的性状，从而为植物品种改良和创建新种质开辟新的技术途径。目前分别采用融合法和电融合法成功地进行了西瓜原生质体的融合，通过Southern分子印记杂交技术，检验出了原生质体异融合愈伤组织。李仁敬等[11]以西瓜子叶原生质体获得愈伤组织。

5 体细胞无性系变异及其离体筛选

体细胞突变体筛选是实用性很强的细胞工程技术，目前已作为抗性育种的重要手段用于作物的抗性资源创新，通过对离体培养中体细胞无性系变异的筛选和鉴定，符少萍等对西瓜离体培养再生植株的RAPD分析，发现约有25%的再生植株出现多态性，其中高浓度BA中形成再生植株的变异率高，证明体细胞无性系变异可能与培养中激素成分和浓度有一定关系[12]。 朱天圣等[13]通过对西瓜体细胞无性系的筛选和鉴定，获得了抗枯萎病毒素的体细胞突变系， 为西瓜抗枯萎病育种提供了很有价值的抗原材料。马国斌等[14]对西瓜体细胞无性系变异进行了初步研究， 结果表明：西瓜未成熟子叶和幼苗子叶的再生植株中存在明显的变异， 其中以四倍体变异最为普通，且有嵌合变异现象。

6 转基因

西瓜生产中病毒感染严重，影响产量和品质。农杆菌介导法是植物特别是双子叶植物遗传转化的主要方法，Choi等[15]以西瓜子叶外植体，将抗性筛选基因（NPTⅡ）和标记基因（GUS） 利用根癌农杆菌改造株系LBA 4404有效地转入2个不同西瓜品种。王春霞等[16]以子叶为外植体，通过与含有改造后分别携带嵌合NPTⅡ基因和番茄的ACC合成酶基因及其反义基因的质粒的根癌农杆菌共培。王慧中等[17]也采用农杆菌介导法，将WMV-1cp基因导人西瓜后，又将WMV-2cp基因导入浙密2号西瓜，经Southern验证获得3个转化株，进一步研究表明，CP基因符合1对基因遗传，并培育成高抗WMV-2的转基因纯合株系。利用基因枪法来转移重组DNA是农杆菌介导的基因转移外的另一种方法。在利用基因枪（PIG）轰击之后，Compton等[18]描述了GUS在子叶中最佳的瞬时表达参数，然而利用这种方法并没有得到稳定的整合重组DNA。利用此法的许多转基因植物高度不育，且外源基因在植物基因组内的遗传不稳定。西瓜基因工程最好的方法是把基因枪法和农杆菌介导的转基因结合起来。

7 展望

在我国，离体培养已广泛地应用于西瓜的快速繁殖、品种改良以及遗传转化研究。但目前仍存在一些缺陷，体细胞胚胎发生过程中畸形胚的发生还未找到有效的控制方法；花药与花粉培养成功的报道还不多；由原生质体再生出完整植株仍然比较困难；遗传转化中目的基因的来源比较单一。这些问题尚有待于广大学者作进一步的研究与探讨。应重视各种细胞工程技术的实用化研究，加强基础研究与应用研究的联系，是西瓜细胞工程的研究成果能尽快应用到育种工作中，以丰富西瓜的种质资源，改进育种方法，提高育种效率，使西瓜育种技术水平上一个新台阶。

（收稿：2013-02-28）

参考文献

[1] Compton ME （1999） Dark pretreatment improves adventitious shoot organogenesis from cotyledons of diploid watermelon. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 58： 185188

[2] Compton ME （2000） Interaction between explant size and cultivar impacts shoot organogenic competence of watermelon cotyledons. HortScience 35： 749750

[3] Zhang XP， Rhodes BB & Adelberg JW （1994a） Shoot regeneration from immature cotyledons of watermelon. Cucurbit Genet. Coop. Rep. 17： 111115

[4] Srivastava DR， Andrianov VM & Piruzian ES （1989） Tissue culture and plant regeneration of watermelon （Citrullus vulgaris Schrad. cv. Melitopolski）. Plant Cell Rep. 8： 300302

[5] Srivastava DR， Andrianov VM & Piruzian ES （1989） Tissue culture and plant regeneration of watermelon （Citrullus vulgaris Schrad. cv. Melitopolski）. Plant Cell Rep. 8： 300302

[6] Choi PS， Soh WY， Kim YS et.al（1994） Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 13： 344348

[7] Compton ME （1999） Dark pretreatment improves adventitious shoot organogenesis from cotyledons of diploid watermelon. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 58： 185188

[8] 薛光荣，余文炎等.西瓜花药离体培养获得花粉植株.植物生理学通讯1983，NO.4.40-42；

[9] 魏瑛. 低温预处理对西瓜花药愈伤组织诱导的影响，甘肃农业科技1999，（5）34-36

[10] 袁万良、付润民等.西瓜花培试验初报. 陕西农业科学1995，（1）29-30.

[11] 李仁敬.孙勇如.西瓜于叶原生质体再生愈伤组织的获得.新疆农业抖学.1992.（5）；218-220

[12]符少萍，李继红，西瓜离体培养及再生植株变异的分析检测[J]热带农业科学，1999（4）：24-28

[13] 朱天圣，虞浩，黄河勋，等，西瓜体细胞无性系抗枯萎病抗性鉴定，广东农业科学，1996（5）：33-34

[14]马国斌，王鸣，郑学勤2003。西瓜体细胞无性系变异初探。上海农业学报，19（3）：9-2。

[15] Choi PS， Soh WY， Kim YS et.al（1994） Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 13： 344-348

[16] 王春霞，简志英，刘愚，等。ACC合成酶基因及其对西瓜的遗传转化.植物学报，l997，39（5）：445-450

[17] 王慧中，赵培杰，徐吉臣，等。转WMP一2外壳蛋白基因西瓜植株的病毒抗性[J].遗传学报，2003.30（1）：70-75

[18] Compton ME， Gray DJ， Hiebert E & Lin CM （1993b） Expression of the β-glucuronidase gene in watermelon cotyledon explants following particle bombardment or infection with Agrobacterium tumefaciens. HortScience 28： 138

作者简介：缑艳霞（1978年-），女，硕士研究生，专业为蔬菜学，中级职称，研究方向是西瓜遗传育种改良，师从浙江大学张明方教授，现职业为大学讲师。张明方，博士，浙江大学农业与生物技术学院教授，博士生导师。