黄连生物碱4种提取方法的比较

摘要：采用超声波法、回流法、冷浸法和酶辅助冷浸法提取黄连生物碱，采用高效液相色谱法对提取液中的生物碱含量进行检测。结果表明，超声波法、回流法、冷浸法和酶辅助冷浸法的黄连小檗碱提取率分别为26.10%、52.24%、54.15%和81.27%；总生物碱提取得率分别为28.66%、59.70%、61.58%和89.36%。酶辅助冷浸法提取黄连生物碱所得提取率较高，优于其他3种提取工艺。

关键词：黄连；生物碱；超声波法；回流法；冷浸法；酶辅助冷浸法

中图分类号：S567.5+2；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5452-02

Comparative Study of 4 Different Extraction Methods for Alcaloids from Rhizoma Coptidis

NING Na，YANG Zheng-shui，HAN Jian-jun

（Department of Pharmacy， Tongren Vocational &Technical College， Tongren 554300，Guizhou，China）

Abstract： Ultrasonic method， reflux method， cold-soaking method and enzyme-assisted cold-soaking method were used to extract alkaloids from Rhizoma Coptidis； and HPLC was used for quantitative analysis of alkaloids. The results indicated that the yield of berberine of ultrasonic extraction， reflux method， cold-soaking method and enzyme-assisted cold-soaking method was 26.10%， 52.24%， 54.15% and 81.27%， respectively. And the yield of total alkaloids of the 4 methods was 28.66%， 59.70%， 61.58% and 89.36%， respectively. The extraction yield of alkaloids of enzyme-assisted cold-soaking method was higher than other three extraction methods.

Key words： Rhizoma Coptidis； alkaloids； ultrasonic method； reflux extraction； cold-soaking method； enzyme-assisted cold-soaking method

黄连（Rhizoma Coptidis）为黄连属植物黄连（Coptis chinensis Franch.）、三角叶黄连（C. deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao）或云南黄连（C. teeta Wall.）的干燥根茎，具有清热燥湿、泻火解毒之功效[1]。黄连主要含有药根碱、巴马汀、小檗碱等生物碱类物质。黄连生物碱的提取方法主要有微波法[2]、超声波法[3]、回流法[4]等。为提高其提取率，本研究在对冷浸法的基础上加入酶辅助提取，并与超声波法、回流法和传统的冷浸法进行比较研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄连药材购自天津药材公司，经天津医科大学生药教研室周晔教授鉴定为黄连（C. chinensis Franch.）的干燥根。主要仪器有Waters高效液相色谱仪、UV-3010/3310分光光度计、PHS-25型精确酸度计等。主要试剂盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱购自中国药品生物制品检定所，批号分别为110713-200208、110732-200506、0733-200005；纤维素酶购自天津利华酶制剂技术有限公司，批号08-03-19，酶活力5 109.52 U/g；果胶酶购自天津利华酶制剂技术有限公司，批号08-05-19，酶活力10 000 U/g。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 黄连生物碱的制备 ①超声波法。取黄连药材（长5～7 mm，下同）1 kg，按1∶10的料液比（m∶V， g/L，下同）加入0.25%的硫酸水溶液，超声波提取3次，每次提取的时间为30 min。收集、合并3次提取得到的提取液，浓缩并定容至250 mL。精确吸取1.5 mL定容至100 mL，进样10 μL。②回流法。取黄连药材1 kg，用0.25%的硫酸水溶液加热回流提取3次，料液比为1∶10，提取时间分别1、2、3 h。收集、合并3次提取得到的提取液，浓缩并定容至250 mL。精确吸取1.5 mL定容至100 mL，进样10 μL。③冷浸法。取黄连药材1 kg，用0.25%的硫酸水溶液冷浸提取2次，料液比1∶10，每次提取时间为24 h。收集、合并2次提取得到的提取溶液，浓缩并定容至250 mL。精确吸取1.5 mL定容至100 mL，进样10 μL。④酶辅助冷浸法。取黄连药材1 kg，按1∶8的料液比浸泡于pH 4.0的0.25%硫酸水溶液，加入0.9%（占药材质量的百分比，下同）纤维素酶并于35 ℃的水浴中酶解2.5 h，再按照③的条件进行常规冷浸提取。

1.2.2 有效成分的测定 ①对照品溶液的制备。精确称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱对照品适量置于同一容量瓶中，加甲醇制成每毫升含盐酸小檗碱28 μg、盐酸巴马汀10.13 μg、盐酸药根碱9.89 μg的混合溶液，摇匀。②色谱条件。色谱柱：DIKMADiamondsil C18 柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相：乙腈-0.1 mol/L 磷酸二氢钾（体积比30∶70），流速：1 mL/min，柱温：40 ℃，AUFS：2.000，进样量为10 μL。通过紫外全波长扫描（200～700 nm），确定检测波长为345 nm。③标准曲线的绘制。取对照品混合液分别进样4、6、8、10、12、14、16 μL进行色谱分析。以标准品的含量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。④黄连生物碱供试品溶液的制备。将黄连药材粉碎，过40目筛，混合均匀，称取样品0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加入体积分数1%的盐酸甲醇溶液至刻度，称重，超声波处理30 min，冷却后称重，加体积分数1%的盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，经微孔滤膜（0.45 μm）过滤，取滤液作为黄连的供试品溶液。

黄连生物碱提取率=提取得到的生物碱质量/（实际药材中的生物碱含量×黄连质量）×100%

2 结果与分析

2.1 黄连生物碱高效液相色谱结果

对黄连生物碱对照品及供试品溶液进行高效液相色谱分析（图1、图2），巴马汀、药根碱、小檗碱的保留时间分别为7.18、10.25和11.85 min。在试验浓度范围内3种生物碱的浓度与峰面积呈良好的线性关系，回归方程分别为Y药根碱=4.16×106X+ 1.00×104，r=0.999 4；Y巴马汀=4.23×106X-1.42×103，r=0.999 8；Y小檗碱=3.86×106X-9.60×103，r=0.999 8。取标准品混合液10 μL，分别连续进样6次，进行精确度测验，得到盐酸药根碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积的相对标准差（RSD）分别为0.75%、0.75%和0.85%，表明检测结果可靠。

2.2 4种方法的黄连生物碱提取率结果

4种方法中黄连生物碱的提取率结果如表1所示。由表1可知，超声波法、回流法、冷浸法和酶辅助冷浸法4种提取方法中，酶辅助冷浸法的小檗碱、巴马汀和药根碱的提取率均为最高，超声波法的3种生物碱提取率均为最低。超声波法提取率低可能与超声波提取时间较短有关。酶辅助冷浸法中由于使用纤维素酶酶解破坏了植物细胞壁，使有效成分更易溶出，因此生物碱提取得率较传统的冷浸法有较大的提高。

2.3 加样回收率试验结果

精确称取已测含量的黄连原药材过筛粉末9份，每份0.05 g，准确加入对照品适量，按“1.2.2”的方法制备黄连生物碱供试品溶液并测定3种生物碱的含量。盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为99.46%、98.85%、99.51%。

3 小结与讨论

参照文献[5]、[6]在预实验中分别以纯水、0.25%的硫酸水溶液、乙醇及酸醇为溶剂提取黄连中的生物碱，以总生物碱提取率及小檗碱提取率为指标，结果表明超声波法、冷浸法及回流法中以0.25%硫酸水溶液和酸醇的提取得率较高。从工业生产成本、安全及对环境的影响考虑，本研究选择0.25%硫酸水溶液作为提取溶剂。

试验结果表明3种提取黄连生物碱的传统工艺中以冷浸法的生物碱提取得率最高，略高于回流法的提取率。加入生物酶辅助提取后黄连小檗碱的提取率达到81.27%，总生物碱提取率达到89.36%，比传统冷浸法分别提高了50.08%和45.11%。酶辅助冷浸提取法的建立对进一步加强黄连药用资源的开发和利用有积极意义。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：一部[Z].北京：化学工业出版社，2000.

[2] 王道武，庞 雪，赵全成，等.微波辅助提取黄连生物碱及其毛细管电泳分析[J].广东化工，2010，37（10）：35-37.

[3] 肖谷清，龙立平，王娇亮，等.微波、超声及其联用萃取黄连中总生物碱的比较研究[J].光谱实验室，2010，27（3）：844-849.

[4] 汪兰芳，方优妮，王 平，等.正交试验优选失眠贴中黄连乙醇回流提取工艺[J].湖北中医学院学报，2010，12（5）：31-33.

[5] 徐 媛，张 琰，刘 新，等.正交试验法优选黄连中小檗碱提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2011，18（5）：60-62.

[6] 胡宝平，税丕先.小檗碱提取工艺研究进展[J].泸州医学院学报，2011，34（2）：214-216.