外植体和植物生长调节剂对盾叶薯蓣愈伤组织诱导的影响

摘要：以盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）茎段和叶片为外植体，研究了不同植物生长调节剂对盾叶薯蓣愈伤组织诱导的影响。结果表明，茎段作外植体更有利于盾叶薯蓣愈伤组织的诱导，最佳的愈伤组织诱导培养基为MS+1.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA，诱导30 d时愈伤组织诱导率达100%，愈伤组织为浅黄色、质地疏松、颗粒状；以叶片为外植体，愈伤组织诱导培养基中添加1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA时诱导率最高，为93.75%。盾叶薯蓣愈伤组织的生长曲线呈“S”型，0～12 d为延迟生长期，增重缓慢；12～30 d为指数生长期，生长旺盛，增殖迅速；30～36 d为缓慢生长期，因此诱导的愈伤组织需在接种后30 d内继代培养。

关键词：盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）；外植体；植物生长调节剂；愈伤组织

中图分类号：S632.1；S339.4+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3693-04

盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis C. H. Wright）是薯蓣科薯蓣属多年生缠绕草本植物，又名黄姜，火头根等，为中国特有种[1]，主要分布于四川、湖北、湖南、云南和陕西等地[2]，其根茎富含的薯蓣皂素是合成甾体激素和甾体避孕药的主要原料[3]，可用于治疗冠心病和心血管病，也可用于抗癌、防衰老、避孕和治疗多种疾病，还是灭杀钉螺、防治血吸虫的理想药物，在医药界有“药用黄金”的美称。由于早些年只采不栽，已使盾叶薯蓣野生资源面临枯竭[4]。合理开发利用盾叶薯蓣资源，改变其资源短缺的局面十分迫切。盾叶薯蓣的人工栽培虽缓解了薯蓣皂素生产中原料不足的矛盾，但普遍存在薯蓣皂素含量低和种质退化的问题[5]。因此，选育薯蓣皂素含量高的盾叶薯蓣优良单株，并建立高效的快速繁殖体系在盾叶薯蓣商业化栽培中具有重要意义。随着生物技术的发展，利用组织培养技术对药用植物进行品种的改良及快速繁殖，可以更加方便、快捷和大量地得到有效成分含量较高的植株，具有广泛的应用前景。本研究以盾叶薯蓣试管苗的茎段和叶片为外植体，研究了不同植物生长调节剂种类和浓度组合对愈伤组织诱导的影响，并绘制愈伤组织的生长曲线，以期为盾叶薯蓣优良高产无性系的筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盾叶薯蓣试管苗来自河南师范大学“四大怀药”组织培养研究室。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组的诱导 在超净工作台上将试管苗叶片切成面积约0.5 cm×0.5 cm的小块，茎段切成长1.5 cm左右的小段，分别接种到愈伤组织诱导培养基中。愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，含3%的蔗糖和0.6%的冷凝脂，调pH为6.0，121 ℃灭菌20 min，分别添加不同的植物生长调节剂组合2，4-D（0.5、1.0、1.5 mg/L）+6-BA（0.5、1.0 mg/L）或NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）+6-BA（0.5、1.0 mg/L）。培养条件为培养温度（25±2） ℃、光照度2 000 lx、光照时间14 h/d。观察愈伤组织的生长情况，30 d时统计并记录愈伤组织诱导率、愈伤组织量和愈伤组织生长情况。

愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的外植体个数/接种的外植体总数×100%。

1.2.2 愈伤组织的继代培养及生长曲线的绘制 将诱导形成的愈伤组织转入筛选出的最佳诱导培养基中进行继代培养，每瓶接种3.0 g。接种后每3天取样1次，每次随机选取3瓶材料，称其鲜重，取平均值，以愈伤组织增重量（g/L）为纵坐标、培养时间（d）为横坐标绘制愈伤组织的生长曲线。

愈伤组织增重量（g/L）=收获量（g/L）-接种量（g/L）

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂对茎段外植体愈伤组织诱导的影响

以长1.5 cm左右的茎段作外植体，分别接种在含不同植物生长调节剂浓度组合的愈伤组织诱导培养基上，接种后8 d茎段两端出现膨大迹象，部分茎段从中央开始膨大；11 d后从膨大处诱导出白色、颗粒状的愈伤组织（图1A）；随培养时间的延长，愈伤组织的量也逐渐增多，逐渐覆盖住整个茎段，愈伤组织颜色和质地也有变化（图1B）。30 d时盾叶薯蓣茎段外植体愈伤组织的诱导情况见表1。从表1可以看出，6-BA浓度相同时愈伤组织诱导率随2，4-D浓度的升高呈升高趋势，而2，4-D或NAA浓度相同时愈伤组织诱导率随6-BA浓度的升高总体呈升高趋势。其他条件相同时，添加NAA与6-BA的培养基中愈伤组织的诱导率和愈伤组织量均低于添加2，4-D与6-BA的培养基，诱导率最高为93.75%，最低仅为75.00%。培养基中添加1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA时愈伤组织诱导率最高，达100.00%，愈伤组织浅黄色、质地疏松、呈颗粒状，且诱导形成的愈伤组织量也较大。

2.2 植物生长调节剂对叶片外植体愈伤组织诱导的影响

以面积约为0.5 cm×0.5 cm的叶片作外植体，分别接种在含不同植物生长调节剂浓度组合的愈伤组织诱导培养基上。观察发现，接种后9 d叶片边缘切口处开始褪绿、卷曲并膨大；12 d时开始出现少量白色颗粒状愈伤组织（图2A）；随培养时间的延长，愈伤组织的量也逐渐增加，在叶片中央也逐渐开始形成白色点状的愈伤组织（图2B）。有部分叶片不能诱导形成愈伤组织，叶片在培养过程中逐渐变黄、变褐，然后死亡。30 d时盾叶薯蓣叶片外植体愈伤组织的诱导情况见表2。从表2可以看出，培养基中添加NAA和6-BA时，叶片外植体的愈伤组织诱导率较低，最高为56.25%，最低仅为27.78%。培养基中添加2，4-D和6-BA，叶片外植体的愈伤组织诱导效果较好，6-BA浓度一定时，愈伤组织诱导率随2，4-D浓度的升高呈先升高后降低的变化趋势，而2，4-D浓度相同时，培养基中添加1.0 mg/L 6-BA的诱导效果比添加0.5 mg/L 6-BA时差。培养基中植物生长调节剂组合为1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA时愈伤组织诱导率最高，为93.75%，愈伤组织呈浅黄色、质地疏松、颗粒状，且诱导形成的愈伤组织量也较大。

2.3 愈伤组织生长曲线的绘制

盾叶薯蓣愈伤组织的生长曲线见图3。从图3可以看出，盾叶薯蓣愈伤组织的生长曲线呈“S”型，可分为延迟生长期、指数生长期和缓慢生长期3个时期。0～12 d为延迟生长期，愈伤组织增重缓慢，可能是由于接种初期愈伤组织对培养基内营养成分吸收不充分所致。12～30 d为指数生长期，愈伤组织生长旺盛，增殖迅速。随着培养基中营养物质的消耗和代谢产物的积累，愈伤组织生长逐渐变慢，并开始出现衰老迹象，愈伤组织进入缓慢生长期（30～36 d）。因此，愈伤组织需在培养后30 d内继代，以保持其旺盛的分裂能力和细胞活性。

3 小结与讨论

3.1 外植体类型对愈伤组织诱导的影响

已有的研究结果表明，盾叶薯蓣不同类型外植体诱导愈伤组织的效果并不相同。本试验用盾叶薯蓣的茎段和叶片作为外植体诱导愈伤组织，发现外植体对愈伤组织诱导的影响较大，且茎段作为外植体时诱导效果要优于叶片。李琼等[6]分别以盾叶薯蓣茎尖、叶片和幼嫩果荚为外植体诱导愈伤组织，结果发现茎尖外植体出愈率高，不易污染，且愈伤组织诱导时间短，是组织培养较理想的外植体材料。莫英等[7]比较了茎段、叶片和叶柄对愈伤组织诱导形成的影响，结果也认为以茎段为外植体诱导愈伤组织效果最佳。综合看来，茎段或茎尖更适合作为诱导盾叶薯蓣愈伤组织的外植体。

3.2 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

生长素类物质是最早被发现的植物激素[8]，它作为一类重要的生长调节物质，影响细胞的分裂、伸长、细胞形态建成、根的发育、顶端优势以及对光和重力的响应等多种生理过程[9]。NAA在较低浓度下促进细胞生长，在高浓度下促进细胞成熟衰老。本研究结果表明，在本试验设计的生长素浓度范围内（2，4-D 0.5～1.5 mg/L，NAA 0.5～1.5 mg/L），2，4-D促进盾叶薯蓣茎段和叶片外植体愈伤组织诱导的效果要好于NAA，添加1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA的培养基中茎段外植体愈伤组织诱导率达100%。晏婴才等[10]认为，在0.5～2.0 mg/L范围内，2，4-D诱导盾叶薯蓣愈伤组织的效果明显优于NAA；在6-BA的浓度相同的情况下，同浓度2，4-D的诱导率显著高于NAA，这与本研究的结果是一致的。

参考文献：

[1] 郭永兵，李 峰. 腐植酸对盾叶薯蓣种子萌发及幼苗生长的影响[J]. 湖北农业科学，2010，46（2）：256-258.

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[3] SAUTOUR M， MITAINE-OFFER A-C， LACAILLE-DUBOIS M-A. The dioscorea genus： A review of bioactive steroid saponins[J]. Journal of Natural Medicines，2007，61（2）：91-101.

[4] 董静洲，易自力，蒋建雄，等. 盾叶薯蓣综合研究概况[J]. 湖北农业科学，2004（2）：84-88.

[5] 黄贤兰，郭华春. 不同倍性盾叶薯蓣的核型分析[J]. 热带亚热带植物学报，2012，20（3）：256-262.

[6] 李 琼，李 静，姜 玲，等.盾叶薯蓣愈伤组织的诱导及芽分化与增殖[J]. 贵州农业科学，2010，38（7）： 15-17.

[7] 莫 英，兰利琼，卿人韦，等.盾叶薯蓣种子萌发条件及诱导外植体愈伤的研究[J].四川大学学报（自然科学版），2004，41（4）：837-841.

[8] 周 索，余晓丽，杨建伟，等. 异三聚体G蛋白在NAA诱导的拟南芥根生长发育中的作用[J].西北植物学报，2006，26（8）： 1617-1620.

[10] 晏婴才，林宏辉，代其林，等. 盾叶薯蓣组织培养与快速繁殖研究[J]. 四川大学学报 （自然科学版），2002，39（1）：136-140.