指纹图谱技术在植物研究领域中的应用

摘要：文章对指纹图谱的产生及其概念进行了介绍，综述了国内外有关指纹图谱研究的进展。论述了指纹图谱的作用、构建程序以及指纹图谱研究过程中存在的问题。重点探讨了现代分析技术在指纹图谱研究中的应用，最后，对指纹图谱技术的研究前景进行了展望。

关键词：指纹图谱；药用植物；研究；应用

随着中国加入WTO，药用植物产品如何被世界所认同和接受，已经成为中医药产业面临的重要课题。实践证明系统分析药用植物的化学成分，阐明有效部位和活性成分的种类是可行的，建立全面反映所含活性成分的指纹图谱，将更加有效地体现药用植物活性成分的整体性和综合作用，从而更好地评价药用植物的质量。

一、指纹图谱的产生与研究进展

（一）指纹图谱的概念

指纹图谱是经色谱或光谱测定得到的组分群体的图谱或图像。中药指纹图谱是指某种（或某产地）中药材或中成药进行适当处理后，采用一定的分析手段得到的、能够标示该中药材或中成药特性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱，它具有特征性和稳定性。指纹图谱能全面、综合地反应和控制中药或天然药物质量。

（二）国内外研究进展

植物药指纹图谱的研究始于20世纪70年代，但主要限于学术界。德国和法国联合开发银杏叶提取物Egb761，找到了最佳银杏提取物的指纹图谱，导致植物药在欧美重新流行。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代末就已普遍采用色谱方法来监控其产品质量。韩国、日本、德国等，都比较重视对植物药的开发和利用。中药指纹图谱技术是随现代分析技术的发展而诞生的。中国中药指纹图谱研究最早可以追溯到20世纪60年代，但由于当时的主客观条件限制和时机不够成熟，这些探索没能继续下去。后来不断有人研究，但主要限于学术研究的层面，在传统的中药质量控制模式中，没有指纹图谱的要求，所以对中国中药产业没有任何触动。

近年来，随着中药现代化、国际化的深入发展，政府、企业和研究人员越来越清醒地认识到控制中药的质量是亟待解决的关键技术之一。中国中医研究院中药所的指纹图谱标准规范化研究，对一批中药材进行检查、鉴别、含量测定等指纹图谱方面的基础性研究，从而建立起一套完整的对中药材质量全面综合的评估系统。中国国家药品监督管理部门也于2000年了《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准。2003年，国家采用中药指纹图谱检测标准后第一个批准上市的中药注射剂已正式投产。中国在中药指纹图谱取得的成绩得到了国际同行的肯定，WHO也因此委托国家药品监督管理局起草《国际草药标准》。

二、指纹图谱的作用及其构建

（一）指纹图谱的作用

指纹图谱在评价中药质量中的作用主要可以概括为观察指纹图谱的整体特征以鉴别生产前药材的真伪；指纹图谱可以区分植物药材的不同部位；可以考察商品药材及成药的质量；从标准指纹图谱可追踪制剂中某些化学成分的变化；可以检测原料与成品之间，成品的批间质量的稳定性。中药指纹图谱是从宏观上整体把握中药质量，而不是分析单一的、少量的成分。使评价中药质量更加科学化、标准化。通过指纹图谱可以鉴别样品的真伪优劣。指要建立稳定的中药指纹图谱必须规范原材料的来源，因此中药指纹图谱对中药种植GAP实施起到指导监督作用。

（二）指纹图谱的构建

构建指纹图谱的主要步骤：样品采集、方法建立、数据分析、样品评价和方法检验。应收集10批以上相互独立、具有代表性的原料药材和多批次半成品、成品样品进行分析，并且应注意将与产品功能主治相关的有效部位尽可能完全地提取出来。测定指纹图谱后，标定各生产步骤指纹峰及相似度，即可起到对药品从原料到成品进行全过程质量控制的作用。系统全面取样后的提取成分应尽可能全面。研究人员在找出各样品共同成分的同时，更注重发现不同来源（不同品种、产地或栽培条件）样品问的差异。

三、现代分析技术在指纹图谱研究中的应用

（一）薄层色谱（TLC）

薄层色谱法用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描的扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，还可计算各峰的峰面积与标准峰的比作量化指标，因而具有更好的指纹鉴别意义，是目前应用最广泛的建立指纹图谱的方法。在新药研制中，几乎所有的新药都必须提供薄层色谱，并需附有标准品或对照药材、阴性样品对照的彩色图片。在实际的薄层层析鉴别中，因药用植物成分的性质相近而难以分开时，还可采用高效薄层色谱法。微乳薄层色谱法（ME-TLC）是最新发明的一种技术。与传统的TLC法中的有机溶剂相比，它具有无毒，不可燃，可操作性强，价格便宜等优点。由于其具有诸多优点，目前被广泛应用于分析欧亚甘草属（Glycyrrhiza）植物提取液。它的指纹图谱就能清晰、完整地反映出不同种类的甘草，并能较好地揭示样品中不同成分的特征

（二）高效液相色谱（HPLC）

HPLC具有分离效率高、分离速度快、定量精密度高、检测器种类多稳定性和重现性好等特点，它比GC法应用范围更广。HPLC指纹图谱是现在应用最多的一类，如运用二极管阵列检测器可得到三维图谱。

（三）气相色谱（GC）

气相色谱具有分离效能高、分析速度快等优点，所得的色谱轮廓重现性好、分辨率较高，由于是封闭系统色谱，外界影响因素较少，故稳定性较好，检测设备可选性较大，特别适用于含挥发性成分中药的指纹图谱的研究和应用。

（四）高效毛细管电泳（HPCE）

毛细管电泳已用于中草药中生物碱、黄酮／黄酮苷、酚酸、香豆素、醌类、强心苷、葡萄糖异硫氰酸盐等物质的分析。《中国药典》2005版收载了该方法，从而加速了该方法的研究和推广。在中药分析中最常用的两种模式是毛细管区带电泳（CZE）和胶束电动毛管色谱（MECC）。

（五）高速逆流色谱（HSCCC）

高速逆流色谱是当前国际流行的新型的液一液分配技术。它利用相对移动的两种互不相溶的溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的组分分离，分离效能高、低成本、样品的前处理简单，可适用于任何极性范围样品的分离，因此很适用于指纹图谱分析。

（六）紫外（UV）、红外（IR）光谱

紫外光谱是反映分子内电子吸收紫外光和可见光波段的能量而产生跃迁的吸收光谱。中药中一些含有不饱和结构或共轭双键结构的成分在紫外（通常是200-400nm）照射下，能引起物质内部原子、分子运动状态的变化，不同物质产生的紫外吸收光谱各部形同。由于不同中药所含成分的不饱和程度有差异，因而其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度也有差异，可以此进行鉴定。但目前认为，UV光谱仅能反映部分具有紫外吸收的化学成分，而要对药物成分进行全面评价，还需结合IR、色谱等技术。红外光谱是反映分子内部各种键的振动和转动能给变化的吸收光谱。红外光谱具有高度的特征性，每一种化合物都有自己特征的红外光谱。中药是一个含有多种化学成分的混合物，其红外光谱是混合物中各组分在红外光区域内（400-4000cm-1）总体官能团吸收的叠加。

（七）核磁共振波谱（NMR）

核磁共振是鉴定有机化合物结构的主要方法。通过一定程序获了植物类中药的特征性化学成分的总提取物，同时这些特征的化学成分的含量是相对固定的，则在规范的提取分离条件下，植物类中药的NMR图谱与植物品种存在着严格的对应关系。图谱中的信号强弱反映了混合物中各组分的相对含量。

（八）X射线衍射法（XRD）

X射线衍射法是研究物质的物相和晶体结构的主要方法。当对某一物质进行衍射分析时，该物质被X射线照射而产生不同程度的衍射现象，物质的组成、晶型、分子内成键方式、分子构型、构象等将决定物质产生特有的衍射光谱。如果该物质是一混合物，则所得衍射图是各组分衍射效应的叠加。只要混合物的组成恒定，其衍射图就可作为该混合物的特征谱图。由于衍射法获得的图谱信息量大，指纹性强，稳定可靠，因此可作为该物质定性鉴别的可靠依据。但在进行衍射分析时，由于每一中药含有许多组分，每一成分含有衍射峰而产生相互叠加，最后获得的衍射图会因各组分衍射效应的叠加而使衍射图显得较为复杂，从而给药材鉴别带来困难。

（九）色谱质谱联用技术

采用色谱质谱联用技术建立多维多息特征谱，可使各图谱间相互不存信息，对复杂供试品有更清晰完整的认识。如GC-MS、HPLC-MS、HPLC-MS-MS等可提供大量的各种化学信息，符合解决中药体系的要求。更重要的一点就在于为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供了一条可行之路。因为采用联用技术就能确定混合物中各化学成分的结构。

四、指纹图谱研究过程中存在的问题

（一）药材质量的稳定性

中药化学成分是植物次生代谢产物，对于同一种子，生态环境、栽培条件不同，产物的化学成分不一样。由于药用植物来源的无序性，新技术的应用不能普及，标准化、规范化程度不够而导致的重现性差、不利于指纹图谱的研究应用。只有加强药用植物种植与提取加工的规范化、标准化，才能保证药用植物提取物的质量控制，在分析技术上还需要多学科的渗透，才能保证药用植物提取物指纹图谱的建立和实施。

（二）与药理作用及临床疗效脱节

目前中药的指纹图谱的研究基本上反映的都是化学信息，而不是药效信息，存在指纹图谱与药效脱节的现象，也是指纹图谱最有争议的地方。因此指纹图谱的变化必然引起药理作用的变化，今后应加强指纹图谱与药效相关性研究，以期达到控制了指纹图谱就保证了药物疗效的目的。

（三）指纹图谱的技术问题

在从药材制剂的研究过程中，最好能分别制作中药材、中间体和制剂的指纹图谱。对于复方制剂，由于成分复杂，在一张图谱不能反映全貌的情况下，可以分成几张图谱，用适当的方法将不同极性的成分分开，分别做成指纹图谱。注射剂以水溶性成分为主，尽可能做成一张图谱，不同的制备提取工艺可能会使提取的有效成分有差异。应该分别比较不同工艺的图谱，从而确定其共有峰和非共有峰。此外，在推行中药指纹图谱的同时，应重视与加强药物生产全过程各环节的管理控制，才能生产出品质优良的中药产品。

（四）分析仪器在指纹图谱应用中的局限性

中药色谱指纹图谱的实验中各种仪器是互补，任何仪器不可能进行所有药材的分析，选择方法应视研究对象的实际需要和可能以及按照不同色谱技术的特点和优势而定。薄层色谱的主要不足是“柱效”较低，靠细微特征方可鉴别的指纹特征，重现性及精密度差，灵敏度也不高，对外部环境条件（温度、湿度）要求较高，操作要求规范熟练。挥发性成分当以气相色谱为主，但如何把握一个极为复杂的气相色谱图的处理是一个问题。紫外可见光光度法和红外光谱法所给出的信息是所有化学物质结构信息的加和，不具备指纹特征，但可作为指纹图谱研究的辅助方法。毛细管电泳的高分辨率也有其优势，大分子物质可能更适合，但重现性需要特别注意。联用技术由于其高昂的费用而难于推广。中药指纹图谱一般说来是以HPLC指纹图谱为最基本的方案。

五、展望

目前中药指纹图谱还处于方法学研究及数据积累阶段，中药指纹图谱的应用也仅限于生产中的质量控制，因此建立中药指纹图谱，应考虑其可操作性。随着分析技术的快速发展，为中药指纹图谱的研究、应用及完善提供了技术保证。今后应该利用计算机容量大、速度快的特点，开发与分析仪器相配套的解读指纹图谱的分析软件，使结果分析更科学合理。

参考文献：

1、覃洁萍,张广征,张等.HPLC指纹图谱及主成分含量测定用于蒸制熟三七炮制品的质量控制[J].中成药,2006(10).

2、刘超,刘圆,彭镰心.白花丹药材HPLC指纹图谱的研究[J].西南农业大学学报,2006(6).

3、王婷婷,陈晓辉,胡庆庆.白芷质量的HPLC指纹图谱评价方法[J].药学学报,2006(8).

4、徐德然,王康才,丁静等.不同产地丹参脂溶性成分指纹图谱的比较研究[J].中国野生植物资源,2006(6).

5、迟霁菲,张国刚.粉葛的高效液相色谱指纹图谱[J].沈阳药科大学学报,2006(10).

6、方琴,丁平,魏刚.肉桂挥发油GC特征指纹图谱研究[J].中国药学杂志,2006(1).

（作者单位：神华准格尔能源有限责任公司黑岱沟实业公司。其中，苏小平为助理工程师；全民为工程师）