感停抗流感病毒的实验研究

作者：申元英 杨占秋 王晶 潘云华 郭利军 王涛 白丽

【关键词】 细胞培养

【摘要】 目的 探讨感停抗病毒的疗效。方法 采用微量细胞培养法进行抗病毒疗效和病毒滴定。结果 感停对流感病毒的最小治疗浓度为:3.25μg/ml，感停对流感病毒的治疗指数（therapy index，TI）为8。经最小有效剂量感停作用后，流感病毒的滴度由10 4.3 TCID 50 /0.1ml下降为10 2.3 TCID 50 /0.1ml。结论 感停在体外对流感病毒有一定的治疗作用。

关键词 感停 流感病毒 抗病毒实验 细胞培养

【Abstract】 Objectives To evaluate the therapeutic effect of Ganting against influenza virus.Methods Miˉcro-well cell cultures was adopted to observe anti-viral activity and titer the virus.Results The minimal concenˉtration of Ganting was3.25μg/ml，the titer of influenza virus declined from10 4.3 TCID 50 /0.1ml to10 2.3 TCID 50 /0.1ml after treated by minimal concentration，and the therapy indexwas8.Conclusion Ganting has certain therapeutic effect in fighting influenza virus in vitro.

Key words Ganting influenza virus anti-viral activity cell culture

滇虹药业有限公司根据中药的作用机制研制了一种抗病毒新药???感停外用喷鼻剂。本研究通过感停的抗流感病毒的实验研究，旨在找到一种有效的早期预防和治疗急性上呼吸道病毒感染的药物，并为该药的开发生产提供理论依据。

1 实验材料

1.1 细胞株 狗肾细胞系（MDCK）由武汉大学典型细胞保藏中心提供。细胞生长液为10%新生犊牛血清199培养液，内含100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素;细胞维持液除含新生犊牛血清含量为2%和2μg/ml胰蛋白酶外，其它成分同细胞生长液。

1.2 病毒株 流感病毒为本室保存。病毒型分别为:A/SH/S/84（H 3 N 2 ）E 2 。病毒经MDCK细胞活化增殖，细胞病变（CPE）达75%以上（+++～++++）时收获，滴定其滴度为10 5 TICD 50 /0.1ml。

1.3 药物

1.3.1 供试药 感停喷鼻剂、感停滴鼻剂，批号:030501，供试验用为10倍浓缩液及1倍浓度含2%抑菌剂（聚维酮碘），由昆明滇虹药业公司提供。

1.3.2 阳性对照药 病毒唑，天津药业集团新郑股份有限公司生产，产品批号:030701。病毒唑注射液含量为100mg/ml，使用浓度为10mg/ml。

1.4 主要试剂 199培养基，DIBCOBRL公司生产，批号:1090813。胰蛋白酶，Difico分装，上海金路贸易公司销售。新生犊牛血清，中国云南邓川蝶泉生物血清厂出品，产品批号:20030607002。青霉素，哈药集团制药总厂生产，产品批号:A03062318。链霉素，华北制药公司生产，产品批号:021111。

2 方法

2.1 药物毒性测定分别按下列剂量将感停药液（10X）加入到生长为良好单层的24孔DMCK细胞培养孔:5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90μl/ml，每一药物剂量设3个重复孔，于37℃，5%CO 2 培养箱中培养4天，每天观察药物对细胞的毒性。

2.2 感停的体外抗病毒实验 根据病毒的增殖周期，拟定感停对流感病毒的作用方式共分3组:（1）药物杀病毒作用组:分别将药物（2 -2 稀释）直接和100TCID 50 /0.1ml病毒作用后，再把它们的混合液加到细胞表面，37℃、5%CO 2 孵育2h后，弃上清液，加入细胞维持液培养，观察药物对病毒的直接杀伤作用，连续观察3天。同时设病毒唑（阳性对照）、NS（阴性对照）和细胞对照。每一剂量分别设3个复孔。（2）药物抗病毒吸附组:采用最大细胞毒剂量的感停进行2 -2 稀释，然后加到细胞表面，37℃、5%CO 2 中孵育2h，弃上清液，分别用100TCID 50 /0.1ml流行性感冒病毒攻击细胞，37℃、5%CO 2 中孵育2h，弃上清液，加细胞维持液37℃、5%CO 2 培养，连续观察3天。同时设病毒唑（阳性对照）、NS（阴性对照）和细胞对照。每一剂量分别设3个复孔。（3）治疗组（抗病毒复制、合成组）先分别用100TCID 50/0.1ml流行性感冒病毒吸附细胞，37℃、5%CO 2 中孵育2h，弃上清液，再分别用细胞维持液经2 -2 稀释的最大细胞毒剂量的药物与细胞一起培养，使药物作用于细胞内的流行性感冒病毒以观察药物对病毒的抑制作用，连续观察3天。同时设病毒唑（阳性对照）、NS（阴性对照）和细胞对照。每一剂量分别设3个复孔。最后，滴定最小有效剂量孔的病毒滴度。

2.3 病毒滴定 将各实验组药物作用的细胞培养板反复冻融3次后，合并同一剂量重复孔悬体，分别取0.1ml按10 -1 稀释，滴定细胞冻融液中病毒滴度，并重复3孔。

3 结果

3.1 药物对细胞的毒性作用 感停对狗肾细胞（DMCK）的最大细胞毒性为20μl/ml（26μg/ml）。

3.2 药物作用方式 （1）感停对流感病毒的最小治疗浓度为:3.25μg/ml;（2）直接杀流感病毒的最小浓度为:13μg/ml;（3）感停不能预防流感病毒的感染。

感停对流感病毒的治疗指数 ［1］ （therapy index，TI）等于8。治疗组细胞冻融液中病毒滴度经最小有效剂量感停作用后，细胞冻融液中流感病毒的滴度为10 2.3 TCID 50 /0.1ml，病毒唑组的病毒滴度为10 2.7 TCID 50 /0.1ml，NS对照组的病毒滴度为10 4.3 TCID 50 /0.1ml。

4 讨论

由于病毒属于非细胞型微生物，具有个体微小，结构简单，必须在活细胞内增殖等特点。病毒感染后，一方面，由于临床症状出现时，组织细胞已经出现了严重损伤，另一方面，由于病毒的超级寄生性，迄今，我们较难找到一种对细胞毒性较低而抗病毒活性较高的药物，因此，病毒的预防和治疗一直是各国科学家研究的重要领域。尽早预防和治疗病毒感染对缩短病毒感染疾病的病程和减轻临床症状具有十分重要的社会和经济意义。

研究表明，感停具有直接杀伤流感病毒作用，可避免病毒进入细胞，防止流行性感冒和普通感冒，同时，感停也能抑制胞内病毒的复制，对流行性感冒和普通感冒均有一定的治疗作用，其对流感病毒的治疗指数为8，经最小有效剂量感停作用后，流感病毒的滴度由10 4.3 TCID 50 /0.1ml下降为10 2.3 TCID 50 /0.1ml。

感停对流感病毒无预防作用，说明感停没有和细胞表面的受体结合，可能是由于感停属于中药复方，成分复杂， 针对细胞表面的单一病毒受体的成分含量低，或以复合物形式存在，不能与细胞表面受体结合，从而不能预防病毒的感染。但能直接杀伤病毒和抑制胞内病毒的复制，也证明感停对呼吸道常见病毒具有一定的预防和治疗作用，感停对病毒的直接杀伤作用推测可能是感停中的有效成分对病毒包膜的作用，感停对已经进入胞内的流感病毒也有一定的抑制作用，其作用机制可能是抑制病毒核酸复制或阻止病毒蛋白合成，这有待于进一步研究。

体外（in vitro）药理研究具有快捷迅速、敏感特异、条件易控等优点，在药物的活性筛选、毒性评价与深入细胞分子药理等研究中起重要作用 ［2～5］ 。随着细胞生物学与生物化学技术的不断发展，体外药理研究方法日新月异，使得人们能够更加快速、准确、深刻地认识药物的毒理与药理。但中药成分的复杂性可影响敏感的体外药效的稳定性，同时体外不能体现药物在体内生化转化效应，所以，本实验有待于感停在动物体内进行进一步的抗病毒实验研究，以期获得一种真正有效的抗病毒中药。

参考文献

1 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学，第三版.北京:人民卫生出版社，2002，1720-1729.

2 申元英，杨占秋，刘建军，等.大黄提取液抗柯萨奇病毒B3的实验研究.北京中医药大学学报，1999，22（5）:65-66.

3 申元英，杨占秋，邱雨石，等.含大黄血清抗柯萨奇病毒B3的实验研究.武汉大学学报，1999，45:57-59.

4 申元英，杨占秋，邱雨石，等.空心莲子草抗柯萨奇病毒B3的实验研究.湖北中医杂志，1999，21（4）:190-191.

5 刘盛，陈万生，乔传卓，等.不同种质板蓝根和大青叶的抗甲型流感病毒作用.第二军医大学学报，2000，21（3）:204-206.