鲍鱼内脏多糖的提取及其抗氧化活性研究

摘要:研究分别采用了60℃蒸馏水浸提、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶水解的方法对鲍鱼内脏多糖进行提取,并测定了鲍鱼内脏多糖的还原力、清除羟自由基、超氧自由基能力。结果表明,胃蛋白酶对多糖的浸出率最高,达0.71%。各组多糖均具有良好的抗氧化能力。

关键词:鲍鱼内脏;多糖;抗氧化

中图分类号: R735.7 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-10-0170-2

在鲍鱼加工过程中产生了大量下脚料,如鲍鱼内脏,鲍鱼壳等。其中,鲍鱼内脏占鲍鱼体重达20-30%,含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪及碳水化合物,可开发为饲料,调味料和多糖保健品等产品。鲍鱼内脏多糖具有抗氧化能力,并具有抗癌和增强免疫力的功能。本文运用热水浸提法和酶解法对鲍鱼内脏多糖进行提取,并对其体外抗氧化活性测定,为鲍鱼内脏的开发利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 鲍鱼内脏,由福建省诏安东欣食品有限公司提供;中性蛋白酶(酶活力为1.3×104U/g),购于无锡酶制剂厂;胃蛋白酶(酶活力为1.0×103U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力为1.9×104U/g)购于国药集团化学试剂有限公司,其余药品均为分析纯。

1.1.2 主要仪器 SP-75紫外分光光度计:上海光谱仪器有限公司;DKB-8A电热恒温水槽:上海精宏实验设备有限公司;PB-10pH计;德国赛多利斯科学仪器有限公司;大容量离心机:德国艾本德股份公司;scientz-12B普通型冷冻干燥机:宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取 鲍鱼内脏,去除杂质,用绞肉机绞碎,选用热水浸提法(60℃)、酶解法(胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)分别对100g鲍鱼内脏进行处理,条件如表1所示:

经离心和过滤后,获得浸提液,真空浓缩后,加Sevage试剂(氯仿:正丁醇=4:1)除蛋白,加入10g活性炭粉脱色。过滤除去活性炭后,用3倍体积的95%乙醇进行沉淀,冷冻干燥,即得鲍鱼多糖。

1.2.3 理化性质分析 多糖测定:苯酚硫酸法;淀粉检测:碘-碘化钾反应;蛋白质检测:茚三酮反应;还原糖检测:菲林试剂法。

1.2.4 多糖抗氧化活性分析 多糖还原力测定:铁氰化钾法;清除羟自由基(・OH)能力实验:Fe2+-脱氧核糖体系法;清除超氧自由基(02-・)能力实验:邻苯三酚自氧化法。

2 结果与分析

2.1 鲍鱼内脏原料分析

将鲍鱼内脏的主要成分进行测定,结果如表2所示。测定结果表明,鲍鱼内脏主要由蛋白质、脂肪和碳水化合物构成,其中,碳水化合物含量达5.68%。因此,对鲍鱼内脏多糖的提取具有可行性。

2.2 不同提取方法对鲍鱼内脏多糖含量的影响

对提取过程中各步骤的多糖进行跟踪测定,结果如表3所示。胃蛋白酶对鲍鱼内脏多糖的浸提效果最好,浸提率达0.71%,对比热水浸提组提高了47.9%。中性蛋白酶组的多糖浸提率比热水浸提组提高了10.4%。而碱性蛋白酶组与热水浸提组多糖浸提率相近。多糖经脱蛋白、脱色、乙醇沉淀后其含量具有一定的损失。因此,应该根据活性多糖的性质对提取、纯化方法进行改进。

2.3 多糖理化性质分析

各组粗多糖均呈灰白色粉末,易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂;显示反应表明,实验所提取的粗多糖非淀粉性多糖和还原糖,可能为多糖和蛋白质的复合物。

2.4 多糖还原力测定

多糖的还原力与其抗氧化活性具有一定的相关性。因此,对各组多糖还原力的测定可以间接进行抗氧化能力的比较。如图1所示,四种方法提取的多糖均具有较好的还原力。随着多糖的浓度升高多糖还原力增大,在一定范围内表现出线性关系。中性蛋白酶处理组的还原力最高,其次分别为碱性蛋白处理组、胃蛋白酶组和热水浸提组。

2.5 多糖清除羟自由基能力测定

生物体内羟自由基的含量与其衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬等具有一定的相关性。因此,测定羟自由基清除率是反映多糖抗氧能力的重要指标。如图2所示,四种方法提取的多糖清除羟自由基能力都随着多糖浓度的增加而增加,在高浓度时清除率呈减缓趋势。各处理在低浓度时清除率相差较大,而高浓度时差异较小。其中,碱性蛋白酶处理组的IC50为26.7mg/ml,浓度最低,而温水浸提组的IC50为39.9mg/ml,浓度最高,胃蛋白酶处理组和中性蛋白酶处理的IC50分别为29.6mg/ml和35.2mg/ml。

图1 不同浓度多糖还原力测

图2 不同浓度多糖羟自由基清除率测测

2.6 多糖清除超氧自由基能力测定

超氧自由基是生物体中一类重要的自由基,能损伤生命大分子而导致各种疾病。因此,测定多糖清除超氧自由基能力具有重要的意义。如图3所示,四种方法提取的多糖超氧自由基能力清除率随着多糖浓度的增加而增加,增加一定程度后清除率放缓趋平。其中,中性蛋白酶处理组与热水浸提组对超氧自由基清除率相近,IC50分别为15.1mg/ml和16.5mg/ml。碱性蛋白酶处理组的IC50为43.6mg/ml。胃蛋白酶处理组的清除率最低,当浓度达100mg/ml时清除率仅为31.5%。

图3 不同浓度多糖超氧自由基清除率测定

3 讨论

多糖具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、增强免疫力等功能,已经成为生物活性物质研究的热点之一。目前,对多糖的提取方法主要有:水提法、酶解法、超声波法、临界萃取法等。不同提取方法对多糖的提取率和生物活性具有显著的影响。本研究中,不同提取方法对多糖提取率具有较大的影响,体外抗氧化实验也显示,不同提取方法所得的多糖在清除自由基活性也具有差异。其原因可能是活性多糖在不同的体系中溶解度不同或者是在不同体系中结构发生改变,从而导致提取率和活性的差异。因此,在多糖提取实验中应根据实验需要,选择最佳的方法对多糖进行提取和纯化,才能提高活性多糖的得率。

参考文献

[1] 苗艳丽,方富永,宋文东.鲍鱼内脏的酸水解及其梅拉德反应产物分析[J].南方水产,2009,5(4):54-57.

[2] 王莅莎,朱蓓薇,孙黎明,等.鲍鱼内脏多糖的体外抗肿瘤和免疫调节活性研究[J].大连工业大学学报,2008,27(4):289-293.

[3] 黄丹,钟世荣,严芳,等.紫苏水提取物抗氧化活性评价[J].中国食品添加剂,2010,(3):190-193.

[4] 韩鹤友,何治柯,曾云鹗.羟自由基的分析研究进展[J].分析科学学报,2001,17(1):83-87.

[5] 何学民,秦德安.超氧自由基对人红细胞膜脂流动性的影响[J].华东师范大学学报(自然科学版),1991,(4):54-56.