电针对缺血缺氧性脑损伤大鼠p―AKT表达的影响

[摘要] 目的 探讨电针治疗对大鼠缺血缺氧性脑损伤的保护作用。 方法 新生7日龄SD大鼠90只随机分为假手术组、模型组、电针组（假手术组仅分离双侧颈总动脉），每组再分为3d、7d、21d三个亚组，结扎双侧颈总动脉建造缺血缺氧性脑病模型。HE染色和透射电镜观察脑组织病理和超微结构，酶联免疫吸附试验测定血清中p-AKT蛋白的变化。 结果 病理显示，模型组神经元损伤较重，且随着时间的延长，损伤加重。电针组神经元损伤明显减轻，21d亚组接近于假手术组。电针组血清中p-AKT蛋白水平均有不同程度增加，明显高于同时间点模型组（P

[关键词] 电针；缺氧缺血性脑病；p-AKT；大鼠

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）19-47-04

[Abstract] Objective To explore the neuroprotective effect of electric acupuncture on hypoxic-ischemic brain damage in rats. Methods Total of 90 cases of new-bore aged 7d SD rats were randomly divided into sham-operated group without ligating bilateral common carotid artery， model group and electric acupuncture group which subdivided into three groups of 3d， 7d and 21d. The rats were established hypoxic-ischemic encephalopatly （HIE） models by occluding bilaterally the common carotid arteries. The pathology and ultrastructure of neuron were observed by HE staining and electric microscopy， and the serum level of p-AKT were detected by enzyme-linked immunoabsorbance assay. Results The HE staining shown that the neurons were more damaged along the time longed， while in the electric acupuncture group the neurons were less damaged and similar to the sham-operated group in 21d group. The serum level of p-AKT increased in any extent and significant higher than that in model group at the same time （P

[Key words] Electric acupuncture； Hypoxic-ischemic encephalopatly； p-AKT； Rats

新生儿围产期窒息导致的缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生儿期的常见疾病，是导致儿童智能落后和脑性瘫痪、癫痫等神经系统伤残的主要原因之一。缺血缺氧性脑病后神经细胞坏死及凋亡而导致神经元大量缺失是其导致神经功能缺损的病理基础[1]。缺氧缺血脑损伤后PI3K-AKT信号通路中的p-AKT蛋白表达增加，并参与HIBD中的病理损伤过程，它通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，同时具有减少氧自由基的生成、抑制炎症反应等作用。研究表明，PI3K-AKT通路的过度激活可导致肿瘤的出现[2]，但p-Akt蛋白的增加对缺血缺氧性脑病有保护作用。既往研究[3-4]发现，缺血可诱导p-AKT蛋白表达，随着再灌注时间的延长其表达会下降。针刺治疗对缺血缺氧性脑损伤具有独特疗效，但具体机制尚不清楚。本实验通过建立新生大鼠缺血缺氧性脑损伤（hypoxic-ischemic encephalopatly，HIE）模型，观察针刺百会、大椎、曲池、涌泉四穴对神经细胞及p-AKT表达的影响，进一步探讨针刺对缺血缺氧性脑损伤的疗效及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料及分组

SPF级7日龄SD大鼠90只，雌雄不限，体重14～18g，由青岛市药物检测中心提供，合格证号：scxk鲁20140003。室温20～25℃，母鼠喂养。按区组随机法分为两组假手术组24只及HIE模型组66只。HIE模型组造模期间死亡18只。将最终造模成功的48只大鼠随机分为两组：模型组、针刺组。每组24只，于术后3d、7d、21d进行取脑检测各项指标，每个时间段8只。

1.2 模型建立

大鼠经乙醚吸入麻醉。采用Rice方法并加以改进[5]，结扎双侧颈总动脉，缝合切口。除假手术组，模型组和电针组大鼠置于透明密闭容器中以0.5L/min的速度通入低氧混合气体（浓度为8%氧气和92%氮气），建立缺氧缺血性脑损伤模型。缺氧1.5h后将大鼠放回鼠笼，术后2h仍未苏醒或死亡的动物剔除。

1.3 电针干预方法

（1）假手术组：仅分离双侧颈总动脉不作任何处理；（2）模型组：分离双侧颈总动脉并结扎，缝合切口，不另作任何治疗；（3）电针组：缺血缺氧后第2天起，用0.5寸毫针，直刺大椎5mm；沿皮斜刺百会5mm、直刺曲池10mm、速刺涌泉微出血即可。百会、曲池与电针治疗仪进行连接，以穴位周围皮肤微颤即适，非对称双向连续脉冲波、5～10Hz、3～5V，每日1次，每次10min。以上穴位定位参照大鼠常用的针灸穴位[6-7]。

1.4 观察指标

1.4.1 病理切片 每亚组随机选取4只动物，应用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经心脏灌注4%多聚甲醛溶液200mL，完整取脑，切取视交叉后脑组织（5mm）置4%多聚甲醛溶液后固定2h，蒸馏水浸泡4h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续切片，厚5μm，贴片，4℃保存。石蜡切片常规脱蜡水化，苏木精-伊红染色，光镜下神经细胞核呈蓝色，细胞质呈不同程度的红色。在400倍显微镜（德国，Leica DMI4000B）下，每张切片随机观察皮质区4个不重叠的视野计数细胞，取其均值。以变性细胞指数（denatured cell index，DCI=变性细胞数/细胞总数）表示损伤程度。

1.4.2 电镜观察 各组幼鼠于缺血缺氧后3d、7d、21d腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，心脏快速灌流生理盐水50mL，断头取脑。在鼠脑前囟前后做冠状切开，将脑皮质区组织切成1mm厚度置于2.5%戊二醛中固定24h，1%锇酸固定，梯度丙酮脱水，环氧丙烷置换，环氧树脂Epon812包埋，超薄切片50nm，醋酸铀+硝酸铅双染色，透射电镜观察神经元的超微结构。

1.4.3 酶联免疫吸附试验 各组剩余4只幼鼠于缺血缺氧后3d、7d、21d腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，心尖部取血，在室温下，血液自然凝固，以3000转/min离心15min，取上清。p-Akt Elisa试剂盒（Lot. #： SO30708D）由Biosource International，Inc. USA提供，操作步骤严格按照说明书进行。在全自动酶标仪450nm处读板，以OD值和蛋白浓度为横、纵坐标绘制标准曲线，得出p-AKT的原始数据，根据待测蛋白的浓度和稀释比例，即可计算出单位浓度总蛋白内p-AKT的含量（unit/mg）。

1.5 统计学处理

实验结果采用SPSS17.0 统计软件分析。计量资料以（）表示，多组比较经方差齐性检验后，采用析因分析，组间比较用t检验，以P

2 结果

2.1 HE染色

假手术组神经细胞结构正常，排列整齐紧密， 胞浆呈淡红色，胞核呈蓝色，核仁清晰，各时间点DCI水平较低无明显差异（P>0.05）。模型组3d，细胞质染色不规则，细胞间隙扩大，神经细胞胞质浓缩、深染，DCI=0.60±0.03，较假手术组明显升高（t=14.46， P0.05）；7d可见部分神经细胞固缩、深染，但坏死程度及DCI=0.42±0.04较同时间模型组（DCI=0.71±0.05）明显减轻（t=8.83， P

2.2 神经元超微结构

假手术组神经细胞排列整齐紧密，高倍镜下细胞膜完整、细胞核大而圆。模型组术后1d电镜下大鼠神经元胞膜尚完整，核仁稍增大，常染色质分布不均，线粒体轻度肿胀；3d镜界模糊，有神经细胞坏死征象，表现神经细胞消失，染色质聚集，双层核膜模糊不清，21d神经元损伤进一步加重，细胞质溶解，有空泡形成。电针组1d电镜下神经细胞的改变与模型组相比未见明显差异；3d电镜下，神经元胞体水肿减轻，细胞核核膜、核仁逐渐清晰，细胞质空白减少，针刺后21d大鼠神经元与假手术组差别不明显，胞膜尚完整，核质稍疏松，常染色质尚均匀，偶见肿胀的线粒体及扩张的粗面内质网。见图2。

2.3 ELISA

ELISA检测显示，假手术组大鼠p-Akt水平较低，各时间点间无明显差异（P>0.05）。模型组p-Akt表达升高，明显高于同时间点假手术组水平（P0.05），7d和21d时明显高于模型组（t=9.43，16.02，P

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑病是指各种围生儿期窒息引起的部分或完全缺氧， 脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤，HIE是新生儿神经发育异常和死亡的主要原因之一，可导致各种病发症，如癫痫、脑瘫、智力下降等，重度HIE预后不良率仍高达20.8%[8]，HIBD已经成为全球范围内一个影响孩子们生活质量的重要因素[9-10]。缺氧缺血性脑损伤的发病机制为二次损伤学说及细胞坏死，目前尚无有效的治疗方法。许多研究表明有效针刺治疗可抑制神经元凋亡，并促进各种内源性神经营养因子分泌，但电针抑制神经元凋亡的机制尚不明确，本文通过建立HIE大鼠模型，通过针刺百会、大椎、曲池、涌泉四穴，检测p-Akt通道蛋白浓度变化，了解针刺治疗缺血缺氧脑病的机制。

PI3K/Akt 信号通路是与细胞凋亡有关的主要信号转导通路，是重要的细胞存活信号通路之一[11]。许多研究表明[12-14]，通过激活PI3K/Akt 信号通路可导致肿瘤的产生，抑制PI3K/Akt 信号通路激活可达到治疗肿瘤的目的，缺血缺氧性脑病早期便可导致神经细胞的过度坏死及凋亡[15-16]。研究认为，激活PI3K/AKT信号通路是电针对脑细胞的神经保护机制之一[9，17]，可在不同时间点不同程度的降低凋亡细胞百分率，通过本实验通过病理及电镜观察到针刺7d、21d神经元细胞损伤明显减轻，Elisa检测发现，电针组细胞中p-Akt蛋白浓度较模型组明显升高（P

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（收稿日期：2015-06-16）