血友病因子体外对胃癌细胞BGC?823增殖的影响

【摘要】 目的 研究血管性血友病因子（von willebrand factor，vwf）对胃癌细胞bgc?823增殖和黏附的影响，并初步探讨相关机制。方法 体外培养人胃癌细胞株bgc?823，以vwf抗体（vwf ab）处理；噻唑蓝比色（mtt）法检测细胞增殖活性和细胞黏附能力的变化；用倒置显微镜观察细胞形态学变化。 结果 vwf ab能够抑制 bgc?823细胞的增殖，抑制作用呈剂量及时间依赖性；细胞形态学观察vwf ab作用对细胞生长具有明显的细胞毒作用；mtt黏附实验结果显示vwf ab处理后细胞的黏附率较对照组明显下降（p＜0.05），ⅳ型胶原高浓度组较低浓度组细胞黏附率增大（p＜0.01）。结论 vwf在体外能够影响胃癌细胞bgc?823的增殖，并诱导细胞形态改变，促进细胞与细胞外基质的黏附。

【关键词】 vwf；胃癌细胞；增殖；黏附

effect of von willebrand factor on proliferation and adhesion of human gastric cancer cell line bgc?823 in vitro

wang min, zhang hong, yang ai?jun, liu wei, wang chen?yu, li min

institute of pathology, school of basic medicine, lanzhou university, lanzhou 730000, china

corresponding author: li min, e?mail: abstract：objective to investigate the effect on proliferation and adhesion of vwf in human gastric cancer cell line bgc?823 in vitro, and to clarify its probable mechanism. methods human gastric cancer cell line bgc?823 cultured in vitro was treated with vwf antibody (vwf ab).the effect of vwf on the proliferation and adhesion of bgc?823 in vitro was detected respectively by mtt colorimetric assay. the cell morphological changes were observed with inverted microscope. results vwf ab inhibited the proliferation of bgc?823 in a time?and concentration?dependent manner. significant cytotoxicity of vwf ab on bgc?823 cells was observed by cell morphology. compared with the control group, the adhesion ability of the bgc?823 cells was decreased significantly (p<0.01) after treatment with vwf antibody. conclusion vwf has significant effect on the proliferation of bgc?823 cells and the cell morphological change in vitro, vwf takes an important part in the progress of adhesion on the bgc?823 cells.

key words：vwf; gastric cell; proliferation; adhesion

血管性血友病因子（von willebrand factor，vwf）是一种由血管内皮细胞及巨核细胞合成和释放的大分子糖蛋白，生理状态下参与凝血的发生。目前研究［1］表明与肿瘤的转移关系密切，但对其机制的研究报道较少。为了探索vwf对于肿瘤发生、发展及其恶性生物学行为的影响，本研究通过体外培养胃癌细胞bgc?823，采用vwf抗体进行干预，观察vwf对肿瘤细胞增殖和黏附能力的影响，并初步探讨其作用机制，为vwf临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

rpmi?1640（美国gibco公司）；胰酶（美国amresco公司）；超级新生牛血清（fbs）（杭州四季青生物工程有限公司）；ⅳ型胶原，兰州大学病理研究所自制；四甲基偶氮唑蓝 （mtt）及牛血清白蛋白（bsa）（美国sigma公司）；兔抗人vwf多克隆抗体（ab6994，abcam公司）；人胃癌细胞株bgc?823购于中国科学院上海细胞生物研究所，经预实验检测显示能够表达vwf。

1.2 细胞培养

用含10 ％灭活新生牛血清的rpmi?1640 培养液（含100ku/l青霉素, 100ku/l链霉素）在37℃、

5％ co2及饱和湿度的培养箱中维持培养。

1.3 mtt法测定vwf ab对bgc?823细胞增殖的影响

bgc?823细胞以5×105／ml的密度接种于96孔板中，同时每孔加vwf ab，根据预实验结果使其终浓度分别为0、5、10、20μg／ml，每个浓度平行3孔，对照组加入等体积培养液，置co2培养箱培养。分别于24、48、72h后取出96孔板，弃上清，加200μl／孔无血清rpmi?1640及20μl／孔mtt，4h后弃上清，加200μl／孔二甲基亚砜（dmso）震荡10min混匀，待溶解完全后用酶标仪?ya570值。细胞增殖抑制率计算公式如下：细胞增殖抑制率（ir％）＝（1－实验组a570／对照组a570）×100％。

1.4 细胞形态学观察

bgc?823细胞以5×104／孔的密度接种于6孔培养板内，对照组无干预，常规培养；处理组在培养基中加入vwf ab 20μg/ml；每组3个复孔。24、48、72h时分别于倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。

1. 5 黏附抗体抑制实验

将vwf ab（20μg/ml）加于rpmi?1640培养基中，与bgc?823细胞共培养48h；将96孔板预先分别用3g／ml及1.5g／ml ⅳ型胶原20μl／孔包被，2％ bsa封板处理，加入调好的细胞悬液200μl／孔（5×105／ml）；co2培养箱分别孵育30、60、90、120min后，弃去培养液，pbs冲洗除去未黏附细胞；弃pbs后加入mtt 20μl，及无血清rpmi?1640 200μl，co2孵育3h；吸弃培养孔内上清液，加入dmso 200μl溶解，噻唑兰显色，酶联免疫检测仪570nm测各孔吸光度（a570）值，同时设立相应的rpmi?1640培养对照组。各组重复3次。

1.6 统计学方法

采用spss 11.5统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间差异比较采用方差分析和kruskal?willis检验， p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 vwf ab对bgc?823细胞增殖的影响

mtt法检测结果显示bgc?823细胞的生长受到明显的抑制，随着作用时间延长，抗体浓度增大，增殖抑制率增加，表明抑制作用与浓度和作用时间均呈明显的依赖关系，见表1。表1 vwf ab对bgc?823细胞增殖的抑制率 同一时间不同浓度比较，*： p＜0.05；不同时间同一浓度比较， #：p＜0.012.2 vwf ab对bgc?823细胞形态的影响

对照组bgc?823细胞无形态学改变，呈上皮型贴壁生长，多呈纺锤形、多边形，少数呈长梭形，细胞轮廓清晰，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛，细胞核异型性明显，核仁清楚，细胞质丰富。vwf ab处理48h时细胞分布较对照组稀疏，细胞呈纤维样生长，伪足较长，细胞核及细胞质轮廓折射增强，较粗糙，部分细胞不再贴壁生长，悬浮于培养液中；处理72h时细胞形态失常，胞体变圆和不规则、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，增殖变慢，细胞周围出现碎片，部分细胞死亡后漂浮在培养液中，见图1。

2.3 vwf ab对bgc?823细胞与细胞外基质成分?ⅳ型胶原黏附能力的影响

经 vwf ab作用细胞48h后，随着时间延长（30、60、90、120min），bgc?823细胞在ⅳ型胶原上的黏附增加（p＜0.01），差异有统计学意义；vwf ab处理组与对照组比较，细胞在各时间点上黏附明显下降（p＜0.05），差异有统计学意义；ⅳ型胶原。

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，涉及多种因素的相互作用。oleksowicz等[2]首次报道伴有血道转移的恶性肿瘤患者血浆vwf水平增高；eppert等[3] 研究发现骨肉瘤患者发生远处转移时，转移灶中vwf含量增高；相反terraube等[4]研究发现在vwf基因缺陷小鼠，黑色素瘤自发性肺转移的转移潜能增加。但是在胃癌中，尚没有相关的研究报道，我们推测vwf也参与了胃癌的发生发展。

我们的研究表明，vwf ab能有效抑制胃癌细胞bgc?823的增殖，细胞增殖抑制率随作用时间的延长和浓度增加而增高，具有时间和剂量双依赖性，提示vwf 除了在正常生理状态下参与凝血过程的发生外，亦能够影响胃癌细胞bgc?823的增殖，在胃癌的发生中发挥重要作用。同时通过细胞形态学观察发现，经vwf ab处理后，细胞形态失常，推测vwf可能通过影响细胞的形态，进而改变肿瘤细胞自身的黏附、迁移相关特性，影响肿瘤的转移。

肿瘤细胞的黏附性在其侵袭和转移中起着极为重要的作用[5]。terraube等[4]研究表明黑色素瘤细胞能与vwf发生黏附，呈时间依赖性；noelia 等[6]研究表明vwf抗体能够抑制乳腺癌细胞与细胞外基质的黏附。我们的实验结果证实：用抗vwf抗体阻抗vwf作用后，bgc?823细胞与细胞外基质的主要组成成分－ⅳ型胶原的黏附能力降低，提示了vwf能够促进胃癌细胞bgc?823与基质成分的黏附，推测vwf可能与肿瘤细胞直接黏附，或与肿瘤细胞表面相关黏附分子黏附，通过其“桥梁”作用，促进肿瘤细胞与细胞外基质的黏附，进而改变侵袭、迁移相关性质，促进肿瘤的转移，其具体作用机制还需进一步的研究。

同时，随着时间延长，细胞的黏附率增加，表明肿瘤细胞与细胞外基质的黏附呈时间依赖性。此外，随着ⅳ型胶原浓度升高，bgc?823细胞相应的黏附能力增高，提示ⅳ型胶原能够诱导肿瘤细胞的黏附，呈剂量依赖性，这与胡劲松等［7］关于ⅳ型胶原可通过诱导肿瘤细胞黏附和迁移，从而促进肿瘤细胞浸润和转移的实验报道相一致，进一步表明肿瘤细胞的黏附能力受到多因素、多水平的调节。

综上所述，本实验研究证实了vwf在体外能够影响胃癌细胞bgc?823的增殖，并诱导细胞形态改变；同时能够促进细胞与细胞外基质的黏附，在肿瘤的转移中发挥重要作用。

【参考文献】

［1］ wei sw, jen kl, tzu cl, et al. plasma von willebrand factor level as a prognostic indicator of patients with metastasis colorectal carcinoma[j]. world j gastroenterol, 2005, 11(14):2166?2170.

［2］ oleksowicz l, bhagwati n, deleon?fernandez m. deficient activity of von willebrand’s factor?cleaving protease in patients with disseminated malignancies[j]. cancer res, 1999, 59（9）:2244?2250.

［3］ eppert k, jay s, aneliunas v, et al.von willebrand factor expression in osteosarcoma metastasis[j]. modern pathology, 2005, 18（3）: 388?397.

［4］ terraube v, pendu r, baruch d, et al. increased metastatic potential of tumor cells in von willebrand factor?deficient mice[j]. j thromb haemost, 2006, 4（3）: 519?526.

［5］ sass pm.the involvement of selections in cell adhesion,tumor progression, and metastasis[j]. cancer investigation, 1998, 16（5）:322?328.

［6］ noelia g, chantal l,et al. shear stress induced release of von willebrand factor and thrombospondin?1 in huvec extracellular matrix enhances breast tumor cell adhesion[j]. clinical experimental metastasis, 2005, 22(3):215?223.

［7］ 胡劲松，翟为溶，张月娥，等．细胞外基质对7721 肝癌细胞粘附性及迁移性的影响[j]. 上海医科大学学报,1999,26(4):243?249.