柚皮素对支气管上皮细胞中Smad2蛋白的影响

【摘要】目的：观察柚皮素对支气管上皮细胞中Smad蛋白的影响，并研究其可能的机制。方法 培养HBE细胞，分为对照组、TGF-μ1组和柚皮素干预组。柚皮素干预组分别与25μM、50μM 和100μM的柚皮素共孵育2小时后，与TGF-β1组一起加入TGF-μ1。在加入TGF-β1后30min时，提取对照组、TGF-β1组和柚皮素高剂量组细胞总蛋白，用Western方法检测Smad2水平及磷酸化的Smad2水平。结果 TGF-β1组经TGF-β1刺激30min后，磷酸化的Smad2明显增加，经柚皮素干预后，则随着柚皮素剂量的增加，Smad2磷酸化明显受抑制。而各组的总Smad2水平无明显变化。 结论 柚皮素可能通过抑制Smad2磷酸化影响上皮细胞的生物功能。

【关键词】柚皮素，组织转化生长因子β1（TGF-β1）；Smad2

柚皮素是柑橘类水果提取物，属于发现较早，研究较多的黄酮类化合物。目前已发现柚皮素具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗增殖、抗肿瘤等作用[1-2]。在急性哮喘的动物实验中，柚皮素具有抑制哮喘气道炎症和气道高反应性的作用[3]，但其作用机制仍有待进一步探索。

在哮喘病理生理过程中，TGF-β1在炎症的发生和气道重塑中起重要作用[4]。TGF-β1 最重要的胞内效应因子是Smads蛋白。TGF～β1与细胞膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型受体结合后。Ⅱ型受体可将Ⅰ型受体磷酸化， 随后使Smad 2和Smad3磷酸化并与Smad 4结合形成异三聚体或四聚体进入细胞核， 与靶基因的特异性DNA 元件结合，从而激活靶基因转录[5]。

本实验以人气道上皮细胞为研究对象，研究柚皮素对Smad2的生物学功能的影响，并对其作用其机制进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

BIO-RAD power pac300电泳仪，胎牛血清（杭州四季青公司），Trizol （Invivogen公司），重组人TGF-β1细胞因子（PeproTech公司），柚皮素及Cy3标记羊抗兔二抗（Sigma公司）， Anti-GAPDH 抗体（Abcam公司），Smad2抗体及P-Smad2抗体（Cell Signaling Technology 公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养、柚皮素及生长因子准备

人支气管上皮细胞由江苏省人民医院呼吸科提供。HBE细胞接种于50 ml培养瓶，培养液为1640+10%胎牛血清，每隔3d换液一次，当细胞融合后，用PBS液洗涤两次，胰酶消化，当细胞收缩成圆形后，弃去消化液，加入培养液，无菌吸管吹打数次至贴壁细胞全浮起，接种于六孔培养板，初始细胞接种密度为2×105/ml。

柚皮素用DMSO溶解，终浓度400mM，TGF-b1用培养液溶解，浓度2ng/ml。

1.2.2细胞因子刺激及药物干预

当细胞进入对数生长期、细胞融合达80%～90%时，细胞分组，分为对照组、TGF-b1组、柚皮素干预低剂量组、中剂量组和高剂量组。柚皮素干预组分别与25μ、50μM 和100μM的柚皮素共孵育2h后，与TGF-b1组一起加入TGF-β1（终浓度50pM）反应。在加入TGF-b130min时，提取对照组、TGF-b1组和柚皮素高剂量组细胞的总蛋白，用Western方法检测Smad2水平及磷酸化的Smad2水平。

1.2.3 Western Blotting 法测定HBE细胞 Smad的蛋白表达及磷酸化的Smad表达

在加入TGF-b1后30min时弃去培养液后，贴壁的细胞用PBS液洗两次，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液。提取全蛋白。在玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，取适量待测蛋白加入上样孔中；电泳1～3 h。PVDF膜预浸入甲醇，漂洗后制作三明治夹心，恒压转膜1 h。PVDF膜浸入封闭液，在加入一抗，4℃过夜。洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h。洗膜同前。加入ECL发光液，显色5 min。

1.3统计学分析

采用SPSS 11.5统计学软件，使用One-Way ANOVA检验进行数据统计。以P

2 结 果

用TGF-b1刺激HBE细胞，30min后提取蛋白质检测细胞Smad2磷酸化情况的改变。对照组和TGF～b1组Smad2的表达总量无明显差异，对照组细胞内磷酸化的Smad2检测不出，而TGF-b1组磷酸化的Smad2明显增加，然而，若HBE细胞先与柚皮素共孵育，再经TGF-b1刺激30min后，柚皮素干预组Smad2的表达总量较TGF-b1组相比无明显差异，而磷酸化的Smad2含量较TGF-b1组逐渐降低，柚皮素剂量越大，降低越明显。

3讨论

TGF-β1通过Smad在哮喘病程中起重要的生物调节作用，包括刺激气道和血管的平滑肌细胞增生和肥大，诱导气道成纤维细胞的分裂增殖，增加胶原的合成以及减少胶原的降解等方面，从而在参与组织修复的同时也诱发了气道重塑。

本实验以Smad2蛋白为代表，根据目前已知的Smad2的生物功能进行设计和研究。

Smads蛋白若要行使生物学功能，Smad2需先磷酸化，我们于是检测了TGF-β1刺激后Smad2的磷酸化情况，HBE细胞在TGF-β1刺激30min后，总的Smad2量不变，磷酸化的Smad2明显增加。但我们发现若细胞事先与柚皮素孵育再与TGF-β1反应，随柚皮素剂量增大，Smad2磷酸化水平明显减弱，总的Smad2量不受影响。因此推测柚皮素可能是通过抑制Smad2磷酸化而使TGF-β1的信号无法正常传导，从而影响了TGF-β1的生物功能。

参考文献

[1]Kanno S， Tomizawa A， Hiura T， et al. Inhibitory effects of naringenin on tumor growth in human cancer cell lines and sarcoma S-180-implanted mice. Biol Pharm Bull 2005；28（3）：527～30.

[2] Zieliska-Przyjemska M， Ignatowicz E. Citrus fruit flavonoids influence on neutrophil apoptosis and oxidative metabolism. Phytother Res 2008； 22（12）： 1557-62.

[3] Shi Y， Dai J， Liu H， et al. Naringenin inhibits allergen-induced airway inflammation and airway responsiveness and inhibits NF-κB activity in a murine model of asthma. Can J Physiol Phamacol， 2009.87：729～735.

[4] Makinde T， Murphy RF， Agrawal DK. The regulatory role of TGF-beta in airway remodeling in asthma. Immunol Cell Biol 2007；85（5）：348～56.

[5] Inman G J， Nicolas F J， Hill C S. Nucleocytop lasmic shuttling of Smads 2， 3， and 4 permits sensing of TGF-β recep tor activity. Mol Cell. 2002， 10： 283～294.