苦胆草片HPLC含量测定方法

[摘要] 目的：测定苦胆草片中龙胆苦苷的含量。方法：HPLC法，色谱柱为岛津Shim-Pack CLC-ODS（5 μm，150 mm×4.6 mm ID）；流动相为甲醇-水(30∶70)；流速1.0 ml/min，检测波长270 nm。结果：龙胆苦苷进样量在0.352 8～3.528 0 μg范围内线性关系良好(r=0.999 998，n=6)；加样回收率结果为99.39%，RSD为0.52%(n=6)。结论：本方法操作简便、快速、准确，可作为苦胆草片中龙胆苦苷的定量分析方法。

[关键词] 龙胆苦苷；高效液相色谱法；苦胆草片

[中图分类号]R927.2[文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2009）02（a）-043-02

Determination of Gentiopicroside in Kudancao Tablets by HPLC

LU Yin-sheng

(Institute for Drug Control, Jiangsu Province, Nanjing 210008, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for the determination of Gentiopicroside in Kudancao Tablets by HPLC.Methods: The SHIMADZU Shim-Pack CLC-ODS(5 μm,150 mm×4.6 mm ID)was used,mobile phase was methanol-water(30∶70) with theflow rate of 1.0 ml/min,detective wavelength was set at 270 nm. Results: The linear range of Gentiopicroside was 0.352 8-3.528 0 μg,the average recovery was 99.39% with RSD of 0.52(n=6). Conclusion: This method is simple and accurate,can be used for the quantity control of Gentiopicroside.

[Key words] Gentiopicroside; HPLC; Kudancao Tablets

苦胆草片为中药龙胆制成的片剂，龙胆为龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)、龙胆（Gentiana scabra Bge.）、三花龙胆（Gentiana triflora pall.）或坚龙胆(Gentiana rigescens Franch.) 的干燥根及根茎，前三种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”；春、秋二季采挖，洗净，干燥。龙胆性味苦寒，归肝、胆经，有清热燥湿、泻肝胆火的功效，用于湿热黄疸、阴肿阴痒、带下、强中、湿疹瘙痒、目赤、耳聋、胁痛、口苦、惊风抽搐的治疗。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2010高效液相色谱仪系列；岛津Shim-Pack CLC-ODS（5 μm，150 mm×4.6 mm）色谱柱。

1.2 试药

苦胆草片（雷允上药业有限公司，批号分别为060501、060503、060809、070201、070204、070507）；龙胆苦苷对照品(中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号为770-200105）；甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件

2.1.1 波长的选择参照《中国药典》2005年版龙胆的含量测定，选择检测波长为270 nm。

2.1.2 流动相比例的确定参照《中国药典》2005年版一部龙胆的含量测定方法，采用药典的流动相甲醇-水（30∶70）时，主峰峰形好，且与杂质峰基线分离，故选择此流动相。

2.1.3其他条件柱温35℃；流速1.0 ml/min。

在此条件下，龙胆苦苷和样品中其他组分可达到基线分离，龙胆苦苷与其相邻色谱峰的分离度大于1.5；按龙胆苦苷峰计算，理论塔板数（N）在5 000以上；同时，取阴性供试品溶液进样，结果表明，阴性供试品在龙胆苦苷色谱峰位置处无相应峰出现，因此不会对测定造成干扰。

2.2 线性范围的考察

储备液的制备：精密称取龙胆苦苷对照品约35 mg，置于50 ml容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 ml含龙胆苦苷0.705 6 mg）。精密量取储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0 ml，分别置20 ml容量瓶中，用70％甲醇定容，各进样10 μl。测定峰面积，结果分别为442 755、883 309、1 331 843、1 770 616、2 217 981、4 430 262；对龙胆苦苷峰面积值及进样量进行回归，得标准曲线方程：Y=1.256 089X0.000 323，r=0.999 998，其中Y为峰面积/106，X为进样量的微克数。以上结果表明，在0.352 8～3.528 0 μg范围内，龙胆苦苷峰面积值与进样量有良好的线性关系。

2.3 精密度试验

精密量取对照品溶液10 μl，重复进样6次，测定龙胆苦苷峰面积。结果分别为911 214、909 811、908 948、905 766、908 702、908 888，RSD为0.2％，表明精密度良好。

2.4 稳定性试验

取供试品溶液，分别于0、4、6、8、10、12、24、48 h分别进样10 μl，结果分别为940 557、940 743、939 469、939 354、938 823、938 704、938 387，RSD为0.1％，表明样品供试液在48 h内稳定。

2.5 重复性试验

按拟定的含量测定方法，对同一批样品(批号060501)分别制备5份供试品溶液，进样20 μl，计算含量和相对偏差，其结果分别为3.44、3.44、3.41、3.46、3.44 mg/片，RSD为0.5％，表明拟定测定方法重现性良好。

2.6 回收率试验

取已知含量的样品(批号060501)约0.13 g 5份，精密称定，分别精密加入对照品甲醇溶液（每1 ml含龙胆苦苷0.317 mg）5 ml，挥去甲醇，按供试品溶液制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，依法测定，以下列公式计算回收率，测得结果见表1。

2.7 供试品溶液的制备

2.7.1 提取时间的考察取本品0.3 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，精密加70%甲醇50 ml，称定重量，分别超声不同时间，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，以0.45 μm孔径的微孔滤膜滤过，取续滤液进样，测定龙胆苦苷色谱峰的峰面积。提取5、10、15、20 min的面积分别是979 121、975 193、985 563、987 493。以上结果表明，超声提取超过5 min，龙胆苦苷色谱峰峰面积不再增加，综合考虑工艺及其他相关因素，确定超声提取时间为10 min。

2.7.2 提取方法的考察取本品0.3 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加70％甲醇50 ml，称定重量，超声10 min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量；另取0.3 g，精密称定，精密加甲醇50 ml，放置12 h，不时振摇。过滤后进样，超声和冷浸所得峰面积分别是976 823和902 099。结果表明，超声提取比药典原提取方法更完全，故确定提取方法为超声提取。

2.7.3 提取溶剂的考察取本品三份各0.3 g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加甲醇、70％甲醇和乙醇50 ml，称定重量，超声10 min，放冷，再称定重量，用各自溶剂补足减失的重量；分别过滤后进样，甲醇、乙醇和70％甲醇对应的峰面积分别为945 027、628 306、976 823，结果显示，70％甲醇超声提取比其他提取溶剂完全，且主峰无干扰，色谱峰峰形好，柱效高，故确定提取溶剂为70％甲醇。

2.8 样品测定

取5批（雷允上药业有限公司，批号分别为060501、060503、060809、070201、070204、070507）样品，按正文中供试品溶液的制备及含量测定方法测定龙胆苦苷含量，含量分别为1.16、0.98、1.25、1.34、1.27、0.87 mg/片。

3 讨论

在测定过程中，比较了其他各不同比例的流动相，结果在本法中流动相比例的条件下，龙胆苦苷的出峰时间较为恰当，分离良好；改用不同色谱柱如DIKMA Kromasil、Agilent ZORBAX SB、Phenomenex Luna C18柱比较，均能较好分离。综上，本方法操作简便、快速、准确，可作为苦胆草片中龙胆苦苷的定量分析方法。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2005.64.

[2]国家食品药品监督管理局.中药新药研究的技术要求[S].北京:国家药品监督管理局,1999.

（收稿日期：2008-09-09）