改良线栓法大鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立

【摘要】 目的：通过改良线栓法建立稳定的Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型。方法：60只雄性Wistar大鼠，参考Longa法并适当改进建立大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型30只，对照组30只。实验组结扎右侧颈总动脉近心端，夹闭颈总动脉远心端，颈总动脉剪一小口，从颈总动脉经颈内动脉插入线栓，缺血1 h后，在麻醉状态下完全拔出线栓，并结扎颈内动脉远心端。对照组结扎右侧颈内动脉近心端及远心端，但不插入线栓。术后取脑组织行TTC染色，并进行神经功能评定。结果：经改良线栓法制作脑缺血再灌注损伤模型，成功率达82.75%，平均操作时间约（20.4±5.3）min，模型大鼠右侧眼裂变小，行走时向右侧转圈，模型大鼠神经功能评分均在3～4分，经TTC染色梗死侧大脑半球颜色苍白，脑梗死区范围一致，梗死体积约（34.62±5.32）%；对照组无任何临床症状，无神经功能缺失表现，经TTC染色无梗死灶。结论：通过改良，成功建立了Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型。

【关键词】 线栓法； 大鼠； 脑缺血； 再灌注

缺血性脑血管病（Ischemic cerebral vascular disease，ICVD）是神经科的常见病、多发病，缺血后再灌注损伤（ischemia-reperfusion，IR）较为普遍[1]。目前制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型中，线栓法大鼠大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型能最大程度模拟人类缺血性卒中发生，被广泛用于实验性脑缺血再灌注（Ischemia-reperfusion，IR）损伤的研究[2]。传统的线栓法脑缺血再灌注损伤模型，多经颈外动脉插入线栓，通过颈内动脉到达大脑中动脉，以造成大脑中动脉供血区的缺血、梗死，缺血2 h后拔出线栓，形成再灌注损伤，从而成功制作模型[3-4]，但该操作需分离颈总动脉、颈内及颈外动脉，操作时间相对较长，对大鼠损伤较重。在本实验中，笔者通过改良，仅分离颈总动脉，颈内、颈外动脉近心端，在颈总动脉切一小口，将线栓经颈总动脉，通过颈内动脉插入至大脑中动脉，造成大脑中动脉供血区缺血，缺血1 h后拔除线栓，成功制备了MACO模型，现将该方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠60只，体重200～250 g，购自兰州大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 3.6%水合氯醛，10%多聚甲醛，头端包被多聚赖氨酸、已消毒的MCAO线栓[型号2432-A4，线头直径为（0.32±0.2）、线身直径为0.24 mm]购自北京沙东生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 改良大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型的建立 参考Longa等的报道，随机选取30只雄性Wistar大鼠，术前12 h禁食，但不禁水。采用3.6%水合氯醛，对大鼠按1 mL/100 g体重的剂量进行腹腔注射麻醉后。剃须刀颈部皮肤备皮，取仰卧位，固定于手术台上，颈部用碘酒、酒精消毒后，取颈部正中切口，长约2 cm，切开皮肤及皮下组织，锐性分离颈前正中肌群，将肩胛舌骨肌向外侧牵拉，颈前正中肌群向内侧牵拉，暴露右侧颈总动脉，小心剪开包裹颈总动脉（common carotid artery，CCA）及迷走神经的鞘膜，将颈总动脉与迷走神经分离开，并沿CCA向远端分离出颈内动脉（internal carotid artery，ICA）及颈外动脉（external carotid artery，ECA）近心端，结扎CCA近心端，动脉夹夹闭CCA远心端，以5-0丝线在CCA中段放置一打好结的丝线，勿收紧线结，用显微剪将CCA近心结扎端远侧剪一小口，插入线栓，将丝线打紧，以保证线栓能自由活动，但又不经动脉破口渗血；松开CCA远端动脉夹，缓慢将线栓经CCA、ICA置入大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA），当出现阻力时即可停止前进，以湿的生理盐水纱布覆盖颈部伤口，线栓缺血1 h后，取下覆盖创口的纱布，在麻醉状态下，缓慢拔出线栓至CCA，结扎CCA远心端后，完全退出线栓，去除牵拉肩胛舌骨肌及颈部舌前肌群的缝线，缝合颈部皮肤。另设对照组30只，颈部正中切口，牵开颈部舌前肌群及肩胛舌骨肌，分离CCA、ECA及ICA，结扎CCA近端及远端，不插入线栓，操作完毕后，缝合肌肉及皮肤。两组大鼠术中均放置于恒温毯上，直至术后清醒。两组大鼠术后均连续3 d肌注青霉素4000 U/d。

1.2.2 大鼠神经功能缺陷体征的观察 所有大鼠均在模型成功后观察大鼠行为。参考Zealong评分标准进行神经功能评分[4]。0分：无神经功能缺陷征；1分：一侧前肢部分屈曲；2分：一侧前肢完全屈曲；3分：向偏瘫侧转圈；4分：向偏瘫侧倾倒；5分：不能自发行走，意识丧失。

1.2.3 TTC染色和HE染色 所有大鼠分别于造模后6 h断头后取脑，观察脑底有无血凝块，动脉环有无血栓形成以排除蛛网膜下腔出血和继发性血栓形成，将脑组织以生理盐水冲干净，-20 ℃放置15 min，行冠状位切片，厚度为2 mm，置2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）中，避光37 ℃染色约20 min后，4%多聚甲醛固定，放置于透明玻璃板上拍照。

1.2.4 脑梗死体积的测定 以图像分析软件（Image Pro-Plus，IPP）对脑梗死体积进行分析，采用梗死率表示梗死体积（梗死体积比率：各切面梗死面积相加之各/各切面面积相加之和×100%）。

2 结果

2.1 模型成功率 两组模型大鼠共60只，其中3只死于麻醉意外，实验组1只，对照组2只，被排除。实验组成功制作模型 24只，失败3只，2只死亡，成功率为82.75%，模型平均操作时间约（20.4±5.3）min。对照组无死亡，平均操作时间为（12.5±4.8）min。

2.2 神经功能缺失评分 实验组模型中，24只模型大鼠右侧眼裂变小，左侧肢体偏瘫，左侧肢体疼痛觉减退，行走时多向右侧转圈。所有模型大鼠神经功能评分均在3～4分，其中17只大鼠神经功能评分达3级，7只达4级。而对照组无任何临床症状，无神经功能缺失表现，所有大鼠神经功能评分均为0分。

2.3 TTC染色 所有大鼠取脑观察，脑底均无血凝块，Willis动脉环均未见血栓形成。实验组大鼠梗死侧大脑半球外侧面大部分颜色苍白，其余部分染成均匀红色，经IPP软件分析，各实验大鼠脑梗死体积基本一致，梗死体积约（34.62±5.32）%。对照组经TTC染色，全脑均染成均匀红色，未见梗死灶。

3 讨论

缺血性脑血管病是严重威胁现代人类健康的重大疾病，其中脑缺血再灌注损伤又占缺血性脑血管病的绝大多数。建立一种具有良好重复性、简便、易行的，并能最大程度模拟人类缺血性卒中发生的局灶性脑缺血动物模型，是缺血性脑卒中研究的关键问题之一[5-6]。其中，以大鼠大脑中动脉闭塞模型运用最为广泛，闭塞大脑中动脉的方法有开颅机械闭塞法、开颅电凝大脑中动脉法、线栓法、微栓子栓塞法、化学刺激导致血栓闭塞法、光化学诱导血栓形成法和内皮素灌注诱导血管收缩法等[3，7-9]。

理想的试验性脑缺血动物模型应该具备以下条件：能重复闭塞单根脑血管；能引起相应供血区的血流量改变或梗死发生；能实现缺血梗死区再灌注。在众多脑缺血模型中，以线栓法具显著优势，该方法可以有效地阻断大鼠MCA 供血区的脑血流，而且可以模拟血管再通后的再灌注情况。线栓法制备的大鼠MCAO/R模型能满足上述要求，并无需开颅，避免了其他开颅建模法引起的颅内环境（特别是颅内压）改变和颅内感染；线栓法制备的MCAO/R梗死位置和体积比较恒定；能进行永久性和短暂性脑缺血或梗死的研究，特别是实现了脑缺血――再灌注；降低了大鼠死亡率和术后并发症的发生。

传统的线栓制备过程为：颈部切口后，仔细分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，颈外动脉切一小口，或切断颈外动脉，经颈外动脉裂口插入线栓，通过颈内动脉到达大脑中动脉，以造成大脑中动脉供血区的缺血、梗死，缺血2 h后拔出线栓，形成再灌注损伤，从而成功制作模型[4]。但由于大鼠的解剖特点，手术视野小，术中需分离出颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，分离过程中易损伤迷走神经、颈外动脉分支等，分离难度相对较大，易出血，术后发生呼吸抑制，呼吸道分泌物增多，颈部出血等并发症[10]。为此，笔者对该模型制备过程进行改良，采用颈部正中切口，将颈前正中肌群向内侧牵拉，将肩胛舌骨肌向外侧牵拉，经颈前正中肌群―肩胛舌骨肌间隙暴露颈部血管，仅分离颈总动脉，颈内、颈外动脉的近心端，结扎颈总动脉远心端，用动脉夹夹闭颈总动脉远心端，然后在颈总动脉切一小口，将线栓经颈总动脉，通过颈内动脉插入至大脑中动脉，造成大脑中动脉供血区缺血，缺血1 h后，在麻醉状态下完全拔除线栓，结扎颈总动脉远心端，使得右侧大脑半球大脑中动脉供血区由大脑前动脉、后交通动脉、大脑后动脉及相关穿支动脉供血，实验缺血区的再灌注，成功制备了MACO/R模型。

3.1 手术切口的选择 制作MACO/R模型，目前主要有两种切口，一种为正中切口，另一种为颈部旁正中切口[11]。在本实验中，笔者的体会是，采用正中切口较直观，切开颈部皮肤后，小心切开皮下腺体被膜，暴露颈前肌群，沿肌间际进行分离，锐性分离颈前正中肌群，将肩胛舌骨肌向外侧牵拉，颈前正中肌群向内侧牵拉，经肩胛舌骨肌―颈前正中肌群间隙显露深部的颈总动脉及迷走神经。颈总动脉及迷走神经包在颈动脉鞘内，锐性剪开颈动脉鞘，小心分离颈总动脉与迷走神经，切忌对神经及血管进行牵拉、夹持，以免损伤血管内膜，导致血栓形成；或损伤迷走神经，出现心率下降、呼吸抑制等[12-13]。在本组实验中，手术过程中，大鼠心率及呼吸均平稳。

3.2 线栓插入方法的选择 传统的手术方法为颈外动脉剪一小口，或切断颈外动脉，将线栓经颈外动脉裂口插入，经颈总动脉分叉，顺着颈内动脉，入颅阻塞大脑中动脉，缝合伤口，将线栓尾端留于颈部伤口外，留置线栓2 h后，拔除部分线栓至颈总动脉或颈外动脉，剪去多余的线栓[4]。笔者的体会是，由于传统模型制作过程中，分离相对复杂，且部分大鼠迷走神经分支较多，与颈部血管形成襻，包裹血管，分离时不得不牺牲一些分支，从而损伤较大，术后易出现呼吸道并发症。同时，成功制备局灶性大脑中动脉缺血再灌注模型，必然会对迷走神经造成一定的损伤，而左侧迷走神经直接分布于心脏，对心脏功能产生较大影响，因此可能对心脏功能产生直接的影响，甚至往往会造成血压的波动[10，14]。在实验中观察到，分离颈动脉鞘的迷走神经襻和分离颈内动脉时，大鼠有时会出现挣扎、痰鸣和呼吸不规则，大鼠口唇青紫等，采用右侧颈动脉线栓模型可减少对心脏的影响，故该模型成功与否的另一个重要因素是脑外因素尽量要小[15-16]。在本实验中，笔者对分离过程进行改良，选取右侧颈动脉进行线栓模型的制备，术中仅分离颈内动脉及颈外动脉近端，在仔细辨认颈内、颈外动脉后，从颈总动脉插入线栓，小心经颈总动脉、通过颈内动脉，达到阻塞大脑中动脉的目的，在操作中，需注意勿将线栓插入颈外动脉，以确保线栓进入颈内动脉，术中注意保护迷走神经，切忌勿夹持迷走神经，尽量不切断迷走神经分支。

3.3 排除线栓的处理方法 传统的模型制备方法为插入线栓后，缝合皮肤，将线栓末端留置于皮肤外，大脑缺血2 h后拔除线栓至颈外动脉，或全部拔除线栓。这样做的缺点是：若全部拔除线栓，多会导致颈外动脉裂口出血，形成颈部血肿，压迫气管、颈总动脉等，发生严重并发症，拔管后死亡率高。若仅将线栓拔至颈外动脉，然后剪去多余的线栓，这样势必留置线栓于颈外动脉内，若需长时间观察动物模型，存在诱发血栓形成、感染等风险。故此两种方法均不利于MACO/R大鼠的长期观察。此外，研究发现，在大鼠清醒状态下将留于体外的线栓拔出以再通血流，大鼠清醒时，受拔线的刺激会使劲挣扎，引起蛛网膜下腔出血，大鼠死亡率高，于是在给大鼠拔线再灌注时追加，降低了颅内出血率[4]。在本实验中，笔者经颈动脉插入线栓后，将大鼠持续置于保温毯上，并用湿盐水纱布覆盖创面，以减少经伤口丢失体液，缺血时间结束后，在麻醉状态下，直视下完全拔除线栓，并结扎颈总动脉，使得右侧大脑半球经大脑后动脉、后交通动脉等重新获得血供，实现了缺血再灌注，这样，能在大鼠安全状态下拔除线栓，拔除线栓过程中无大鼠挣扎所致颅内出血等风险，在模型大鼠体内不留置异物，没有引起血栓形成及感染等风险，利于实验动物的长期存活。通过本方法改良，术后取脑组织行TTC染色，发现脑梗死区范围一致，神经功能缺失评分均在3～4分，表明模型成功率高，稳定性强。

综上所述，经改良，笔者成功建立了Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型，该模型具简便、易行、稳定、可靠特点，为脑缺血再灌注损伤模型的进一步研究提供了动物模型。

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（收稿日期：2014-07-13） （本文编辑：蔡元元）