吡咯烷二硫代氨基甲酸酯及吡格列酮保护糖尿病大鼠肾脏机制的实验研究

[摘要] 目的 探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)及吡格列酮(PIO)对糖尿病大鼠肾脏保护作用及机制。方法 链脲佐菌素( STZ )诱导糖尿病模型组大鼠40只,随机分为糖尿病未治疗组(DM组),PDTC治疗组(P组),吡格列酮治疗组(PIO组)和PDTC联合 PIO治疗组(P+P组),正常大鼠作为对照组(NC组)。8周后测定血糖、血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24h尿蛋白(24hUP)及肾重指数(KI);银染观察肾病理改变及免疫印迹测定肾脏NF-κB p65、MCP-1表达。结果 ①与NC组比,DM组及各治疗组KI、血糖、BUN、Scr、24hUP、ECM堆积指数及NF-κB p65和MCP-1表达均明显增加,体重显著减轻(均P

[关键词] 糖尿病肾病; 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯; 吡格列酮; 核转录因子-κB; 单核细胞趋化蛋白-1

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)11-01-05

Protective Mechanism of Pyrrolidine Dithiocarbamate and Pioglitazone on Diabetic Rat Kidneys:An Experimeatal Study

CHEN Wenyu1 XU Xiangjin2 CHEN Pin2 WANG Yanqiao2

1.Fuzong Clinical Medical College of Fujian Medical University,Fuzhou 350025,China;2.Department of Endocrinology,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region,Fuzhou 350025,China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the protective effects of pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) and pioglitazone(PIO) on the diabetic rat kidneys and possible mechanism. MethodsForty streptozotocin-induced diabetic rats were randomly divided into 4 groups:diabetic rats without treatment(DM group),diabetic rats treated with PDTC(P group),diabetic rats treated with PIO(PIO group),diabetic rats treated with combined PDTC and PIO(P+P group),and normal rats were used as control group(NC group). Fasting plasma glucose(FPG),blood urea nitrogen(BUN),serum creatinine(Scr),24h urinary protein(24hUP)and kidneys weight/body weight ratio(KI)were detected after 8 - week treatment. The pathological changes of the kidneys were observed by PASM and the expression of nuclear transcription factor-κB P65(NF-κB P65)and monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) in the kidneys was studied by using western-blot. Results(1)Compared with group NC,the levels of KI,PG,BUN,Scr,24hUP,extracellular matrix(ECM)accumulation index and the expression of NF-κB P65 and MCP-1 were significantly increased,but the body weight was greatly lowered in D,P,PIO and P+P groups(all P

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[Key words]Diabetic nephropathy; Pyrrolidine dithiocarbamate; Pioglitazone; Nuclear factor-κB; Monocyte chemoattractant protein-1

近年来研究表明,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是一种慢性低度炎症性疾病[1],发病机制与众多细胞因子表达紊乱有关。核转录因子-κB(NF-κB)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是必要的细胞因子。NF-κB作为一种重要转录因子,是许多损伤应答、炎症反应基因(细胞因子,组织因子)的一个多效调节因子。MCP-1作为特异性趋化因子,可引起单核巨噬细胞在肾组织浸润,与细胞外基质(ECM)沉积、肾小球硬化密切相关。PDTC是NF-κB特异性的阻断剂,可抑制NF-κB的激活。吡格列酮作为过氧化物酶体增殖受体-γ的配体,用于糖尿病(DM)的治疗以改善胰岛素抵抗。近年来发现也有抗炎作用,确切机制尚未完全清楚。本实验应用PDTC和PIO,旨在观察其对糖尿病大鼠肾脏保护作用及可能的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 50只SPF级雄性SD大鼠,体重180～200g,福州总院动物中心提供。

1.1.2 试剂 ①链脲佐菌素(STZ,美国 Sigma公司);②PDTC(美国Sigma公司);③吡格列酮(PIO,江苏恒瑞医药股份有限公司产品);④β-actin单克隆抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG,HRP标记山羊抗兔IgG,兔抗大鼠MCP-1多克隆抗体,兔抗人NF-κB p65多克隆抗体,均为美国Santa Cruz公司产品;BCA蛋白检测试剂盒、Ecl发光试剂,美国Pierce公司产品;PVDF膜,美国Millpore公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立、分组和处理 新购进的大鼠给予基础饲料适应性喂养1周后,随机分为正常对照组(NC组,n=10)和造模组(n=40)。NC组给予基础饲料喂养(饲料配方:蛋白质22%,脂肪10%,碳水化合物60%,其它8%);造模组给予高糖高脂饲料喂养(饲料配方:10%猪油,20%蔗糖,2.5%胆固醇,67.5%基础饲料)。4周后,NC组大鼠禁食不禁水12h,按2mL/kg体重给予0.1mmol/L柠檬酸盐缓冲液腹腔内注射。造模组大鼠禁食不禁水12h,按30mg/kg体重一次性腹腔内注射2%的STZ(溶于pH4.2、0.1mmol/L的柠檬酸盐缓冲液);2h后恢复高糖高脂喂养,72h后测定随机血糖≥16.7mmol/L,确定为造模成功大鼠。将造模组随机分为糖尿病组(DM组,n=10),PDTC治疗组(P组,n=10),吡格列酮治疗组(PIO组,n=10),PDTC联合PIO治疗组(P+P组,n=10)。按相应组给予PDTC 100mg/kg,或(和)PIO 10mg/kg灌胃(溶于灭菌蒸馏水中),NC组和DM组给予相应体积的灭菌蒸馏水灌胃,每日1次。

1.2.2 标本采集 治疗8周后于处死大鼠前1d,将大鼠置于代谢笼中,留取24h尿。次日用1%水合氯醛(40～50)mg/kg腹腔注射全麻大鼠,下腔静脉采血5.5 mL,分离血清待测生化指标。低温下剥离双肾称重,剪取肾上极少许肾皮质组织,生理盐水冲洗,切成每块约100mg的小块,入干燥管内,保存于-70℃冰箱,待做Western blot;余肾置于10%中尔马林固定,24h后行石蜡包埋,待做光镜检测。

1.2.3 血、尿生化指标测定血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、血糖用日立7600-020全自动生化分析仪测定;尿蛋白定量采用磺柳酸-硫酸钠比浊法测定。

1.2.4 肾重指数(KI)=双肾重(g)/体重(g)。

1.2.5 肾脏病理改变观察 常规制备光镜标本,切1μm厚片,按常规行过碘酸-六胺银(PASM)染色。光学显微镜下观察肾组织形态学变化。根据染色结果,对各组大鼠肾小球病变进行评估。随机选取不重复的肾小球(×400倍),将肾小球病变按ECM堆积情况分为4级:ECM占肾小球面积的0～25%,计0分;占25%～50%,计1分;占50%～75%,计2分;>75%,计3分。每组随机抽取5只大鼠,每只大鼠至少观察20个不重复的肾小球,并计算平均积分作为肾小球ECM堆积指数(accumulation index ECM)。

1.2.6 免疫印迹检测肾皮质NF-κB p65和MCP-1的表达 取100mg肾皮质置于4℃预冷的细胞浆裂解液1mL,冰上匀浆,于EP管中静置20min,加入10% NP-40 10μL;剧烈振荡10秒后,4℃14000g离心2min,吸取上清即为胞浆蛋白提取液,分装存于-70℃,用于检测MCP-1。提取后的沉淀物,加入细胞核裂解液500μL,在低温下充分离散沉淀物,振荡15min后,静置15min,4℃14000g离心10min,收集上清即为胞白提取液,分装存于-70℃,用于检测NF-κB p65。用BCA法测定蛋白含量。取40μg样品蛋白按体积比4:1加入5×SDS凝胶上样缓冲液,100℃煮沸5min后和Marker分别加入加样孔。浆蛋白和白分别经15%和10%的SDS-PAGE电泳后,电转移到PVDF膜上。10%脱脂奶粉-TBST溶液室温封闭4h后,置入加有一抗的10%奶粉-TBST,4℃冰箱孵育过夜(一抗稀释比例:NF-κB p65 1:2000;MCP-1 1:3000;β-actin 1:6000);次日用TBST漂洗后加入HRP标记的二抗,室温孵育2h;TBST漂洗,加入ECL后曝光;用Fluor-s凝胶成像系统分析蛋白条带,蛋白的相对含量以目的蛋白吸光密度×面积与β-actin条带的比值表示。

1.3 统计学分析

数据用SPSS13.0统计软件处理,参数以均数±标准差(χ±s)表示,先用描述性统计和分析研究变量分布,两组间比较采用t检验,多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析方法(ANOVA),设定P

2 结果

2.1 一般情况及生化指标

见表1。实验期间,NC组大鼠体重匀增,状况良好;模型组造模成功率100%,大鼠反应迟钝,体型消瘦,出现多饮多尿等糖尿病症状。无死鼠,部分大鼠皮肤长有脓疱;实验结束时,DM组及各治疗组与NC组相比,KI、FPG、BUN、Scr、24hUP均明显增高(P

2.2 肾脏病理变化

NC组大鼠肾小球、小管结构正常(图1-1);成模大鼠肾小球肥大,DM组肾小球内皮细胞泡沫样变性、基底膜增厚、系膜增生(图1-2);P组系膜增生,小球呈结节状,基底膜轻度增厚(图1-3);PIO组系膜轻度增生,基底膜轻度增厚(图1-4);P+P组系膜增生不明显,小球呈轻度结节状改变(图1-5)。

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2.3 肾小球ECM堆积指数积分比较

见表2。与NC组比,DM组及各治疗组堆积指数明显增加(P

2.4 肾皮质NF-κB p65、MCP-1蛋白的表达水平

见表3、图2。与NC组比,DM组及各治疗组NF-κB p65、MCP-1表达明显增加(P

2.5 相关分析

①分别以24hUP、ECM堆积指数、BUN、Scr为应变量(Y),NF-κB p65表达为自变量(X),采用相关分析方法分析NF-κB p65与上述各应变量之间的相互密切程度,相关系数r值分别为0.899、0.958、0.950、0.870,均P

3 讨论

本研究观察了糖尿病大鼠8周时各组的血糖、肾功能、结构及NF-κB p65、MCP-1表达的改变。肾功能显示,KI、BUN、Scr、24hUP增加。肾病理显示,肾小球肥大、内皮细胞泡沫样变性、基底膜不同程度增厚、ECM增生、系膜扩张、足突融合;小管间质纤维化、炎细胞浸润、局灶性泡沫样变性等改变,均提示出现肾脏明显的损害。

DN的发生发展是多种因素综合的结果,而以糖代谢紊乱为主引起的慢性炎症是DM肾脏病变的重要原因[2.3]。NF-κB和MCP-1均与炎症反应密切相关。持续的高血糖及由之引起的糖基化终末产物(AGEs)增加,产生过多的活性氧族(ROS),导致氧化应激增强,激活NF-κB。后者作为一种多效炎症转录因子,失活状态时与抑制蛋白IκB结合存在于多种细胞胞质中,某些刺激因素可使IκB磷酸化而与NF-κB解离,NF-κB p65-P50二聚体游离后进入胞核,启动一系列与细胞炎症因子有关基因的转录调控和蛋白合成[4]。MCP-1是C-C趋化因子家族成员之一。动物实验证明,早期DN发生与MCP-1介导的单核细胞聚集和活化密切相关[5]。Ruster C等[6]也发现,DM代谢紊乱可诱导MCP-1在肾组织高表达,募集单核细胞进入肾组织,启动炎症反应导致肾损伤。活化的单核细胞可释放氧自由基、溶酶体酶及一氧化氮,诱导转化生长因子(TGF-β)、血小板衍生生长因子、型胶原合成及黏附分子表达增加,促进系膜细胞(GMCs)增殖和ECM合成,引起肾纤维化、肾小球硬化、小管和间质损伤而影响肾功能[7]。许多趋化因子启动子中含有NF-κB结合位点。K-acetyl[8]实验证实,GMCs核内MCP-1基因起动子部位存在能结合NF-κB的一个基因片段,NF-κB活化能调控其转录表达。有学者研究发现[9],DN患者外周单个核细胞 NF-κB活性明显增高,并与蛋白尿程度相关,而无DN的糖尿病患者,其活性未见明显增高,证实了DN发病机制涉及NF-κB激活。本实验也证实,模型组大鼠的NF-κB、MCP-1在肾组织表达明显升高,并与肾功能、结构、尿蛋白量的改变密切相关(P

从上述NF-κB、MCP-1和DN的关系分析,推测可通过阻断NF-κB的活化,抑制MCP-1的表达,以减轻肾炎性病变。Ruiz-Ortega M[10]在对实验性免疫复合物肾炎的动物模型观察中,发现肾皮质NF-κB活性增高总是伴有局部MCP-1增加以及单核细胞浸润,而血管紧张素转化酶抑制剂干预后,随着NF-κB活性的下降,MCP-1、单核细胞表达与浸润也明显减少,同时肾病变也得到改善。本实验使用抗氧化剂PDTC,可阻止IκB的降解及p65-P50亚基的核转移,阻断NF-κB信号通路,抑制MCP-1的表达。通过PDTC干预的DM大鼠,肾功能随着NF-κB、MCP-1的表达下调而得到改善,与DM相比,有显著性差异。同时也使用另一药物PIO,PIO属于噻唑烷二酮类(TZDs)化合物,临床上作为胰岛素增敏剂,具有降糖、降压、调脂作用而间接保护肾功能。近年来发现对肾脏有直接保护作用。有人通过观察TZD 干预STZ诱导的DM大鼠,在血糖尚未降低下,增高的肾小球滤过率、尿微量白蛋白排泄率已有明显减轻。Gruden G等[11]发现,在高糖和外力联合作用下,系膜细胞MCP-1表达增加,而当把罗格列酮加入培养基中,发现NF-κB、MCP-1都同步下降,且该抑制乃通过降低NF-κB的活性来实现的。说明了TZDs有抗炎作用。本实验使用PIO干预后,发现和PDTC均有降糖作用(PIO更强),肾脏NF-κB、MCP-1的表达明显下调,而且两药联用,下调更明显,肾功能、肾病理改变也进一步改善,差别有统计学意义。我们也注意到,P+P组与PIO组比,血糖有进一步下降趋势,虽无统计学意义,但肾功能各指标仍有显著改善,说明其作用不单与降糖有关。其机制有待进一步探究。

总之,本研究通过高糖高脂喂养结合小剂量STZ诱导的2型DM大鼠8周的观察,发现成模大鼠出现血糖升高、持续蛋白尿、肾功能下降及病理改变,同时肾脏NF-κB、MCP-1表达明显增加。通过药物干预后,两者表达明显下调,肾功能、病理及生化指标均有显著改善。两药联用上述改善更加明显,有统计学意义,提示有更强抑制炎症作用,对肾脏有协同保护作用,其机制可能是通过抑制NF-κB活性,下调MCP-1表达有关。相信随着对炎症反应中细胞信号传导通路进一步阐明,有望找到更具特异性作用靶点的抗炎药物,为DN的防治提供新方法。

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(收稿日期:2010-02-03)

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