多发性骨髓瘤CD19+和CD20+ B细胞的HHV-8感染情况

作者单位：130033长春市中心血站关于多发性骨髓瘤患者的树突状细胞中是否存在HHV8，一直有不同的研究结论，因此，对于该病毒是否是此病的致病原因，也一直存在争议。为了进一步研究HHV8与多发性骨髓瘤的关系，我们在外周血中寻找CD19+和CD20+ B细胞，因为在卡波济氏肉瘤等疾病中观察到B细胞对这些病毒有趋化性。并且，过去的研究曾成功地将HHV8转移到健康供者经培养的CD19+ B细胞中。

我们研究了16位患者的外周血标本。采用德国MiniMACS系统，对CD19+和CD20+细胞进行富集。在梯度离心后，用含有05%小牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤单核细胞2次，然后用抗CD19微球标记CD19+细胞。为了纯化CD20+细胞，将混合多克隆抗人球的终浓度加到5%。用生物素标记的抗CD20抗体，4℃染色20 min。与生物素抗体孵育后，用含有05%BSA和5% Endobulin的PBS洗涤细胞，然后与链霉亲和素磁珠4℃孵育20 min。经过连续两次MS磁柱分选后，富集到带有CD19/CD20的细胞。用免疫荧光试验判断CD19+和CD20+细胞比例。

从细胞分离出基因组DNA。为了确保所分离出的DNA的完整性，将原癌基因bcl2的一个序列进行扩增。

采用巢式PCR对HHV8基因组的ORF26基因进行扩增。用2 μg DNA扩增两轮。第一轮扩增的引物是5CTC GCT CGC CCA GGT ACA TGG ACA GAT CGT CAA G3和5CTG GTT CGG CCC ACG GAC TAC ATC CAA ATT ATG CAG3。 取3 μl第一轮循环的合成产物再次扩增，其引物是5CTC GCT CGC CCA GAT CCG TGT TGT CTA CGT CCA G3和5CTG GTT CGG CCC ATT TTA GCC GAA AGG ATT CCA CC3。在对整个PCR试验电泳后，按照文献中的方法进行southern杂交。

用带有第一轮PCR产物的质粒来检验PCR试验的敏感性。DNA来源于卡波济氏肉瘤。将DNA电泳，从凝胶上切下所需的条带，然后纯化。从菌落中分离带有ORF26序列的质粒。用光密度法测定质粒DNA的浓度。将质粒DNA适当稀释后，每个反应管分别有100，33，10，3，1和03拷贝质粒，然后进行PCR试验。根据泊松分布计算阳性PCR反应的期望频率。

外周血中CD19+细胞的比例为27%~395%，CD20+细胞为36%~267%。经过两次磁柱分选后，前者的富集比例增加到802%~992%，而后者的比例是818%~995%。

对16份CD19+细胞富集和贫化的标本，以及11份CD20+细胞富集和贫化的标本进行分析后，我们没有发现HHV8特异性的扩增产物，尽管含有4拷贝质粒DNA(带有ORF26特异性序列)的阳性对照清晰可见。第二轮扩增产物经过电泳和杂交后，证实了PCR反应是阴性。

经过我们的研究，不论是在B细胞富集的组分，还是在相应的贫化组分中，都没有检测到HHV8序列。我们的研究中包括了新诊断的患者以及处于进展期的患者。试验资料表明，在多发性骨髓瘤患者的外周血中未发现人类疱疹病毒。这与一些文献的报道相符，因此，我们不认为HHV8是多发性骨髓瘤的致病原因。

参考文献

［1］Berenson JR, Vescio RA HHV8 is present in multiple myeloma patients Blood, 1999,93:31573159.

［2］Tarte K, Chang Y, Klein B Kaposis sarcomaassociated herpesvirus and multiple myeloma:lack of criteria for causality Blood, 1999,93:31593163.

［3］Uphoff CC,etcHHV8 infection is specific for cell lines derived from primary effusion lymphomas Leukemia, 2002,12:18061809.

［4］Blackbourn DJ, et al Infectious human herpesvirus 8 in a healthy North American blood donor Lancet, 2005,349:609611.

［5］Bellos F, et al Leukapheresis cells of patients with multiple myeloma collected after mobilization with chemotherapy and GCSF do not bear Kaposis sarcoma associated herpesvirus DNA Br J Haematol, 2007,103:11921197.