钠通道阻滞剂对癫痫大鼠神经元超微结构的影响

【摘要】 目的 研究钠通道阻滞剂对癫痫大鼠神经元超微结构的影响。方法 以钠通道阻滞剂拉莫三嗪为干预因素， 通过制作大鼠癫痫模型， 对比正常对照组、正常给药组、癫痫模型组和癫痫治疗组大鼠神经元超微结构改变。结果 癫痫模型组大鼠神经元胞核、胞质改变明显， 癫痫治疗组神经元线粒体肿胀减轻。结论 钠通道阻滞剂对癫痫大鼠神经元超微结构有影响。

【关键词】 钠通道阻滞剂；癫痫；拉莫三嗪；超微结构

癫痫（Epilepsy）患者的神经元超微结构发生变化， 大量神经元变性、线粒体损伤， 其周围胶质细胞水肿、突触增多， 这些变化影响癫痫的治疗及其预后。新型钠离子通道阻滞剂拉莫三嗪因作用效果好、对神经功能损伤小， 已做为全身强直阵挛的一线药物被临床广泛应用， 此类药物研究多集中在电生理及免疫方面[1， 2]， 对神经系统超微结构影响尚未有人报道。本研究以拉莫三嗪为干预因素， 通过制作大鼠癫痫模型， 对比正常对照组、正常给药组、癫痫模型组和癫痫治疗组大鼠， 研究该药是否对神经元超微结构有影响， 以探讨该药对癫痫转归及预后。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验动物分组 云南系健康成年雄性SD大鼠40只， 体重（350±20）g （深圳宝安区医院动物实验室提供）， 随机分为4组， 每组各10只：①正常对照组（A组）：未给予任何干预措施。②正常给药组（B组）：正常大鼠予拉莫三嗪灌胃。③癫痫模型组（C组）：以马桑内脂为致癫剂造癫痫模型， 未用拉莫三嗪治疗。④癫痫治疗组（D组）：以马桑内脂为致癫剂造癫痫模型， 用拉莫三嗪灌胃治疗。

1. 1. 2 药品试剂、仪器 拉莫三嗪片（商品名 安闲 湖南三金制药有限责任公司）；JEM-1400透射电子显微镜（JEOL）；热膨胀式超薄切片机（Leica）。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 动物模型的制备及取材 每次造模均在上午9∶00～11∶00进行。取大鼠称重后按10 μl/g剂量吸取致癲剂马桑内脂， 微量注射器将马桑内脂注入大鼠脑室内， 观察其活动以Racine做标准：1级：动须、咀嚼；2级：节律性点头；3级：一侧前肢阵挛；4级：站立伴双前肢阵挛；5级：4级+跌倒伴全身抽搐。达到3级或3级以上为制备成功标准。四组在相同条件（清洁、通风、恒温、恒湿）下饲养14 d， 正常给药组、癫痫治疗组每天均在同一时间作灌胃（拉莫三嗪0.15 mg·kg-1·d-1）治疗。

1. 2. 2 固定及取材 作灌注固定， 乙醚麻醉大鼠， 固定四肢， 开胸找到心包膜剪开， 穿刺针从心尖部刺入主动脉时用止血钳夹闭， 先输生理盐水并剪开右心耳观察流出液体量和澄清度， 当流出液体变澄清， 肝脏变白时， 继输4%多聚甲醛， 先快后慢， 见大鼠出现肌抖动消失后继续灌注30 min。破颅骨后完整的取出脑组织放入4%多聚甲醛中继续浸泡固定， 浸泡固定时间为6 h温度4℃。

1. 2. 3 透射电镜 在进行切片之前先将包埋块修整成所需形状和大小， 制好切片刀和水槽。用Leica热膨胀式超薄切片机切片， 厚度40 nm。将超薄切片放到铜网（已泡二甲苯去脂， 晾干并覆上1% Formar膜）上， 经醋酸铀和枸橼酸铅双染色后电镜观察。

2 结果

JEM-1400透射电镜在20000倍下观察：①正常对照组神经元线粒体基质均匀， 电子密度一致， 双层膜和板状嵴清晰， 可见较多的高尔基复合体、滑面内质网， 丰富的线粒体、尼氏体及神经原纤维。其周围星形胶质细胞质较少， 胞质的基质较疏松， 着色均匀， 有疏松分布的核糖体和内质网， 线粒体数量多， 体积小。神经毡内有无髓神经纤维， 有髓神经纤维和大量的星形胶质细胞突起。②正常给药组神经元与正常对照组几乎无差别。③癫痫模型组神经元线粒体肿胀明显， 结构模糊， 嵴变形扭曲、断裂消失， 伴线粒体内、外膜的崩解， 且部分线粒体呈空泡变。主要表现为粗面内质网和高尔基复合体扩张， 线粒体肿胀明显， 髓样变性， 尼氏体溶解， 核膜断裂及胞质水肿。星形胶质细胞胞体肿胀而增大， 细胞质电子密度明显低而清亮， 细胞器未见明显改变。神经毡内胶质细胞突起明显， 因肿胀而增粗， 其终末部分变尖， 细胞外间隙缩小， 神经元的胞突及有髓神经纤维和无髓神经纤维改变不明显。④癫痫治疗组神经元线粒体肿胀仍较减轻， 嵴破裂， 部分线粒体基质中出现边界不清的絮状物， 细胞电子密度增高， 星形胶质细胞胞质及突起肿胀较癫痫模型组减轻。

3 讨论

电压门控钠通道（VGSCs）是内在的神经元和神经肌肉兴奋性的关键因子， 阻滞钠通道减少神经元动作电位产生可用于癫痫治疗， 尤其像SCN1A突变癫痫。而像脑外伤、颅内感染、脑卒中及脑肿瘤等原因造成癫痫时， 大脑神经元结构出现改变线粒体肿胀、细胞器崩解、胞浆出空白区、轴突末梢变性等不同程度的损伤， 钠通道阻滞剂是否有作用？癫痫发病的形态基础如核膜不连续、大量肿大的线粒体、轴突的发芽等神经坏死凋亡的特征， 这些特征导致神经元合成和释放GABA的功能降低神经递质失衡、神经元苔藓状纤维发芽（MFS）建立出返回性兴奋回路。本研究中用药后的神经元超微结构发生改变可以与下列因素有关：①阻滞了Na+内流， 通过钠钙转换蛋白使细胞内Ca2+相应减少。Ca2+可通过NMDA受体减少痫样放电， 同时通过线粒体膜通透性转换孔（mPTP）减轻线粒体水肿， ATP合成增加。②阻滞了Na+内流增加膜稳定， 除可增加细胞阈电位水平外还可增加GABA释放减少癫痫发作。可推断钠通道阻滞剂除了减少发病率外还可减轻神经系统损伤对该病的转归及预后良性影响。

参考文献

[1] Dibue M， Kamp MA， Alpdogan S， et al. Cav 2.3 （R-type） calcium channels are critical for mediating anticonvulsive and neuroprotective properties of lamotrigine in vivo. Epilepsia， 2013， 54（9）： 1542-1550.

[2] Nakatani Y， Masuko H， Amano T. The effect of lamotrigine on Na（v）1.4 voltage-gated sodium channels. J Pharmacol Sci， 2013， 123（2）： 203-206.