补中益气汤含药血清干扰A549/DDP生长作用的实验研究

[摘要] 目的 从细胞水平探讨补中益气汤含药血清改善A549/DDP耐药作用并选择最佳含药血清的浓度。 方法 采用随机对照法将24只SD大鼠分为高、中、低剂量组和空白对照组，制备高、中、低剂量补中益气汤的含药血清，分别以5%和10%的浓度作用于人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP 48 h，观察补中益气汤含药血清对A549/DDP生长的影响并通过MTT法检测各组细胞的抑制率，以此筛选出最佳含药血清浓度，计算出最佳浓度含药血清对A59/DDP的耐药逆转倍数。 结果 补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞有明显抑制作用，且呈浓度依赖关系。5%高剂量组对A549/DDP的抑制率高于5%中剂量组和5%低剂量组，并与5%空白血清组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。10%各剂量组对A549/DDP的抑制率与10%空白血清组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。经筛选，10%中剂量含药血清作用48 h为最佳干扰浓度，在此浓度下，A549/DDP对顺铂的IC50明显下降（ P < 0.05），对A549/DDP细胞的逆转倍数为2.46。 结论 10%中剂量含药血清干扰48 h可作为后期药物实验的含药血清加药浓度及观察时间筛选的实验依据，补中益气汤含药血清可逆转A549/DDP的耐顺铂作用。

[关键词] MTT法；A549/DDP细胞株；A549细胞株；补中益气汤含药血清；耐药逆转

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0004-04

培土生金中药能减轻肺癌化疗引起的毒副反应，有效改善肺癌耐药，提高肺癌临床疗效[1]。培土生金中药代表方剂补中益气汤对多种肿瘤有不同程度的抑制作用，此外抗突变、调节免疫功能、耐缺氧、抑菌消炎等综合作用也多有报道[2]。本实验从细胞和分子水平进一步探讨补中益气汤改善肺癌耐药机制，可为补中益气汤临床疗效提供微观的量化指标，用于最佳含药血清浓度的筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌细胞株A549和人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP 由中国医科院肿瘤研究中心细胞库提供。SD大鼠，体重（200±20）g，清洁级，由辽宁中医药大学动物部提供，动物许可证号：辽实动质（字）（2012-0012号）。

1.2 主要试剂

胎牛血清（FBS）、高糖DMEM培养基购于Hyclone公司，四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于北京鼎国生物技术有限公司，顺铂（DDP）注射液（生产批号2030132DB）由山东齐鲁医药有限公司生产，补中益气方（黄芪、甘草、人参、当归、橘皮、升麻、柴胡、白术）购于辽宁中医院。

1.3 含药血清制备

补中益气汤根据《方剂学》新世纪版中规定补中益气汤的用药剂量（黄芪18 g，甘草9 g，人参6 g，当归3 g，橘皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白术9 g），以临床常用剂量并通过“人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算出大鼠等效剂量，并分别设高、中、低剂量，即1.314 g/mL（生药）、0.576 g/mL（生药）、0.284 g/mL（生药）常规煎煮。SD清洁级大鼠24只随机分成四组：空白对照组（给生理盐水2 mL）、补中益气汤高剂量组（1.314 g/mL，2 mL）、补中益气汤中剂量组（0.576 g/mL，2 mL）、补中益气汤低剂量组（0.284 g/mL，2 mL），灌胃给药每日1次，连续7 d，末次给药1 h后，腹主动脉采血，置无菌管，3500 r/min离心15 min，吸取上清，离心3次，56℃水浴锅灭活30 min，0.22 μm滤器滤过除菌，-20℃冰箱冻存备用。

1.4 细胞培养

A549和A549/DDP两细胞株培养在含10%FBS、青霉素和链霉素各100 U/mL的高糖DMEM培养液中，37℃、95%湿度、5%CO2条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代，每2天换液1次，每3天传代1次。

1.5 MTT法检测补中益气汤含药血清对A549/DDP的影响及最佳作用浓度的筛选

取对数生长期的A549/DDP制成单细胞悬液105/mL，接种于96孔板中，细胞贴壁后分组：5%含药血清高剂量组、5%含药血清中剂量组、5%含药血清低剂量组、5%空白血清组和10%含药血清高剂量组、10%含药血清中剂量组、10%含药血清低剂量组、10%空白血清组及空白对照组（未加细胞，加空白培养液），每组均设6个平行孔。5%高、中、低剂量含药血清组和5%空白血清组中分别加入10 μL各被测试样品血清及190 μL含5%胎牛血清的高糖DMEM培养液。10%高、中、低剂量含药血清组和10%空白血清组中分别加入20 μL各被测试样品血清及180 μL高糖DMEM培养液。继续培养48 h，加入5 mg/mL的 MTT 20 μL作用4 h，弃上清，加入二甲亚砜（DMSO）150 μL，置摇床混匀10 min，酶标仪在波长490 nm处测每孔的光密度（A值），取平均值。根据公式计算细胞抑制率（IR）=[1-（试验组A均值-空白对照组A均值）/（10%胎牛组A均值-空白对照组A均值）]×100%。以上实验重复3次。

1.6 MTT法测定A549/DDP对DDP的耐药倍数

取对数生长期的A549和A549/DDP细胞，制成单细胞悬液105/mL，接种于96孔板中，实验分组：空白对照组、10%空白血清组、10%空白血清+不同浓度DDP组。DDP组中DDP采用的终浓度为6、12、25、50、200、400 μmol/L，每组均设4个平行孔，每孔共200 μL。分别为A549和A549/DDP加药后将96孔板再放于37℃、5%CO2环境中，培养48 h后取出细胞，每孔各加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，再培养4 h后，倾去培养液，每孔加入DMSO 150 μL，置摇床混匀10 min，用酶标仪在波长490 nm处测定每孔的A值，取4个平行孔的平均值。按前述公式计算出IR及半数抑制浓度（IC50），耐药倍数（RI）=A549/DDP的IC50/A549的IC50。以上实验重复3次。

1.7 MTT法检测最佳浓度补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞耐DDP作用的逆转倍数

将对数生长期的A549及A549/DDP细胞，制备成浓度为105/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，实验分组：空白对照组、最佳浓度含药血清组、最佳浓度含药血清+不同浓度DDP组，DDP的终浓度为6、12、25、50、200、400 μmol/L，每组均设4个平行孔，每孔共200 μL。加药培养48 h后取出细胞，加入5 mg/mL 的MTT溶液20 μL，再培养4 h后，倾去培养液，加入DMSO 150 μL，置摇床混匀10 min，酶标仪在波长490 nm处测每孔的A值，取平均值。根据公式计算出IR、IC50，计算评价逆转效果使用的指标逆转倍数（RF），RF=药物IC50（不加逆转剂） /药物IC50（加逆转剂）。以上实验重复3次。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补中益气汤含药血清对A549/DDP生长状态的影响

倒置显微镜下观察发现，对照组细胞成簇生长，细胞大小基本一致，呈圆形或椭圆形，折光性较弱；而补中益气汤含药血清处理各组细胞数量减少，细胞形态发生改变，细胞体积大小不一，轮廓不规则，折光性增强。

2.2 含药血清最佳作用浓度的筛选

从不同剂量、不同浓度的含药血清对细胞的抑制率分析：含药血清作用48 h后，5%高剂量组对A549/DDP的抑制率高于5%中剂量组和5%低剂量组，并与5%空白血清组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；10%各剂量组与10%空白血清组比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05），10%补中益气汤含药血清对A549/DDP的抑制率明显随剂量的增高而增加，呈剂量依赖关系，且10%高剂量组对A549/DDP的抑制率>10%。有研究指出，大于10%抑制率的含药血清浓度有明显的细胞毒作用，不能作为应用的药物浓度[3]。因此，应采用无细胞毒性浓度作为补中益气汤含药血清的实验剂量。10%中剂量组的抑制率大于10%低剂量组和5%高剂量组，说明10%中剂量补中益气汤含药血清干扰48 h对A549/DDP生长抑制效果最好，可作为后期药物实验的含药血清加药浓度及观察时间筛选的实验依据。补中益气汤含药血清对A549/DDP的影响见表1。

2.3 A549/DDP细胞对顺铂的耐药性

MTT法测定不同浓度DDP对A549和A549/DDP的抑制率，结果显示，DDP对A549的IC50为（29.72±0.77）μmol/L，DDP对A549/DDP的IC50为（210.57±1.02）μmol/L，RI=A549/DDP IC50/A549 IC50=7.09。

2.4 10%中剂量补中益气汤含药血清对A549/DDP的耐药逆转情况

10%中剂量补中益气汤含药血清作用不同浓度DDP组后，抑制率值均增大。DDP+10%中剂量补中益气汤含药血清作用对A549的IC50值为（22.88±0.26）μmol/L，RF为1.30；DDP+10%中剂量补中益气汤含药血清作用对A549/DDP的IC50值为（85.51±1.54）μmol/L，RF为2.46，与A549组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

体内和体外环境差距很大，在体外对中药研究的结果，应用到有机体内未必会达到预想的效果。为获得直接准确的实验数据，并最大程度缩小因体内外环境不同而造成的差异，本研究应用血清药理学方法对中药进行体外实验。中药血清药理学研究方法由日本学者于1984年首次提出[4]，是指给动物经口用药后，在一定的时间采血，用含药血清代替药物进行体外实验的一种研究方法。本实验引入血清药理学方法，体外研究中药复方补中益气汤含药血清对肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的影响，使补中益气方药通过口服，经体内代谢发挥直接或间接的治疗效果，取得的动物血清中含有中药的体内代谢产物及中药诱生的细胞因子产物等，用于体外实验，反映补中益气方药的药理效应，提高实验结果的可信度[5]。

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，化学药物治疗占据了很重要的地位。含铂类化疗方案——NP方案是治疗非小细胞肺癌常用的标准一线方案，但其总有效率仅为42%左右[6]。肺癌细胞对DDP耐药是化疗失败的重要原因之一，由于耐药的发生，中晚期非小细胞肺癌的经验性化疗疗效长期停滞于平台期[7-8]。自1970年，Bielder等[9]首次报道肿瘤对药物的多药耐药现象后，肺癌的耐药也引起了人们的重视，因此，寻找有效逆转肺癌顺铂耐药的药物是改善肺癌化疗的关键。肿瘤耐药机制繁多，涉及细胞内多种蛋白、酶和基因的A改变以及细胞外环境的变化等多个环节[10]，即化疗失败的主要原因是由于多药耐药（multi-drug resistance，MDR）现象的产生，而肿瘤的这种MDR的产生是多途径、多基因共同参与的过程[11-12]。

以往对补中益气汤的研究集中于其改善晚期肺癌化疗毒副反应的作用上，按照国际抗癌协会1997年修订的《肺癌TNM国际分期方法》[13]，符合Ⅲb～Ⅳ期标准的肺癌，属于晚期肺癌范围，无手术指征，应用化疗。但化疗药大多损伤脾胃，脾胃虚衰导致气血生化无源，更使正气亏虚、气血瘀滞，病症经久不愈。因此，治疗晚期肺癌需补虚扶正、培本固元、益气补血、健脾补肾，达到“扶正驱邪”的目的[14]。补中益气汤中党参、黄芪补气，白术、山药、谷芽、麦芽健脾，升麻、柴胡升举清阳。药理研究证明，补中益气汤可调节胃肠运动，拮抗小肠抑制，促进蠕动[15]，抑制基础胃酸分泌，维持胃黏膜有效血流及促进胃蛋白合成，对易损伤性的胃黏膜有修复作用[16]。因此，能对抗化疗药引起的胃肠道不良反应。临床实践也证明，健脾益气法可改善肺癌患者化疗后出现的气血不足的表现[17]，它不仅能改善荷瘤体的体质状况，还可以调节荷瘤体的免疫功能，来增强自身的抗肿瘤作用。与此同时，本研究发现，补中益气汤联合化疗药物可使肺癌细胞的抑制率增加，即补中益气汤可帮助逆转肿瘤的耐药作用，这可能也是在临床应用其治疗中晚期肺癌取得了较好效果的原因之一。

本研究MTT检测结果表明，补中益气汤含药血清对人肺腺癌耐药细胞A549/DDP具有体外生长抑制作用，并呈剂量依赖关系，作用48 h时，10%中剂量为补中益气汤含药血清的最佳作用浓度。各浓度DDP与含药血清合用后，对A549/DDP的抑制率明显增大，DDP对A549/DDP的IC50从（210.57±1.02）μmol/L降低到（85.51±1.54）μmol/L，RF达2.46倍。提示补中益气汤含药血清对A549/DDP不但有明显的抑制作用，还具有部分逆转A549/DDP细胞耐DDP的作用。

综上所述，本研究结果可为临床逆转肺癌MDR、制订合理的治疗方案提供理论参考，但补中益气汤含药血清对A549/DDP耐药逆转的具体机制还需进一步研究。

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（收稿日期：2013-04-23 本文编辑：程 铭）