HPLC法测定不同制法的四逆汤中3种苯甲酰类乌头碱及6—姜酚含量

【前言】HPLC法测定不同制法的四逆汤中3种苯甲酰类乌头碱及6—姜酚含量由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。药材黑附子、甘草、干姜均购于山东济南建联中药店，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定为黑附子（毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.）的子根炮制加工品、干姜（姜科植物姜Zingiber officinale Rose.）的干燥根茎、甘草（豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis ...

摘 要 目的 建立高效液相色谱法同时测定四逆汤中苯甲酰类乌头碱、6-姜酚的含量，比较3种方法制备的四逆汤中有效成分含量差异。方法 苯甲酰类乌头碱的测定采用C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1 mol·L-1醋酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为235 nm，柱温30 ℃。6-姜酚测定采用C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）以乙腈-甲醇-水（ 40： 5： 55）为流动相等度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm，柱温25℃。结果 3种不同方法提取液中苯甲酰类乌头碱的提取率依次为：有效部位组合法>药典法>传统法。6-姜酚的提取率依次为：传统法>药典法>有效部位组合法 。结论 所建立的方法简单、准确，为四逆汤提取方法改进提供科学依据。

关键词 四逆汤 苯甲酰新乌头碱 苯甲酰乌头原碱 苯甲酰次乌头碱 6-姜酚

四逆汤出自《伤寒论》，由附子、干姜、炙甘草组成，用于阳虚欲脱，冷汗自出，四肢厥逆，下利清谷，脉微欲绝等证。近年来研究发现四逆汤具有很好的抗心肌缺血、再灌注损伤及保护心肌的作用[1～3]。炮制后的附子中单酯型生物碱是四逆汤抗心肌缺血的关键有效成分[4]，主要包括苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等，干姜中的6-姜酚也是四逆汤重要有效成分之一，具有改善心肌舒缩性能，缓解心衰症状作用[5]。本实验采用hplc法测定苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、6-姜酚的含量，比较传统水提法、药典收录的水提醇沉法及有效部位组合法制备的四逆汤中以上4种有效成分的含量差异，对四逆汤提取工艺的改进提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司，四元泵、自动进样器、恒温箱、DAD检测器，Chem Station 色谱工作站）； Mettler AE240电子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-250E型医用超声波清洗器（群山市超声仪器有限公司）；恒温振荡器（国华仪器有限公司）；RE-52C旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

药材黑附子、甘草、干姜均购于山东济南建联中药店，经山东中医药大学生药系李峰教授鉴定为黑附子（毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.）的子根炮制加工品、干姜（姜科植物姜Zingiber officinale Rose.）的干燥根茎、甘草（豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的炮制加工品；苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、6-姜酚对照品（供含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为RFS-B-100713、RFS-B-110305、RFS-B-110328、A0218，含量均> 98%）；色谱用水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇、乙醇、醋酸铵、异丙醇、二氯甲烷为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 苯甲酰类乌头碱对照品的制备：分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱与苯甲酰次乌头原碱对照品适量，加入异丙醇-二氯甲烷（1：1）制成浓度分别为0.95 mg·mL-1、0.97 mg·mL-1、1.10 mg·mL-1的单一对照品储备液。分别精密吸取上述储备液适量于同一容量瓶中，用异丙醇-二氯甲烷（1：1）稀释至95 μg·mL-1、97 μg·mL-1、55 μg·mL-1，即得3种组分的混合对照品溶液。

6-姜酚对照品的制备：精密称取6-姜酚对照品适量，加75%甲醇制成0.7 mg·mL-1的对照品储备液。精密吸取上述储备液适量于容量瓶中，加75%甲醇制成浓度为70 μg·mL-1的6-姜酚对照品溶液。

2.1.2 3种不同制法四逆汤供试液的制备 传统汤剂：黑附子50 g，炙甘草50 g，干姜33 g（均过20目筛），加入8倍量水浸泡1 h后，煎煮30 min，过滤，残渣加6倍量水煎煮20 min，过滤，滤液合并，浓缩至250 mL，冷藏备用。

药典复方提取液：黑附子50 g，炙甘草50g（均过20目筛），加入8倍量水加热回流提取2 h，过滤，残渣加6倍量水再加热回流提取1 h，过滤，滤液合并。取干姜粉末33g（过20目筛），加12倍量水，水蒸气蒸馏提取5 h，蒸馏后水溶液备用，残渣加6倍量水煎煮1 h，过滤，煎液合并再与附子、炙甘草提取液合并，浓缩至100 mL，加无水乙醇300 mL，静置10 h后离心，取上清液，旋蒸浓缩至250 mL，冷藏备用。

有效部位组合液：黑附子粗粉50 g（过20目筛），24倍量pH=1.0盐酸溶液振荡提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液[6]。炙甘草粗粉50 g（过20目筛），20倍量0.3%氨水-60%乙醇加热回流提取4次，每次2 h，过滤，合并滤液[7]。干姜粗粉33g（过20目筛），14倍量水浸泡3 h后水蒸气蒸馏提取5 h，蒸馏后水溶液备用，残渣加6倍量水煎煮1 h，煎液与上次蒸馏后水溶液合并[8]。将各单味药提取液转移合并浓缩为250 mL，冷藏备用。

2.1.3 HPLC供试液的制备 苯甲酰类乌头碱供试液的制备：分别取传统提取液、药典法提取液、有效部位组合液各10 mL于90℃水浴蒸干（折合溶液中所含黑附子量为2g），精密加入异丙醇-二氯甲烷（1：1）混合溶液溶解残渣并转移至5 mL容量瓶中，过滤，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过即得复方供试液1～3。

6-姜酚供试液的制备：分别取传统法提取液、药典法提取液、有效部位组合液各5 mL（折合干姜药材量0.66 g）置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀静置过夜，过滤，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过即得复方供试液4～6。

2.2 色谱条件与系统适用性

Aglient Extend XDB-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL；苯甲酰类乌头碱的流动相为乙腈-0.1 mol·L-1醋酸铵溶液（0 -40 min，25%乙腈40%乙腈），检测波长为235 nm，柱温30 ℃。6-姜酚的流动相为乙腈-甲醇-水（ 40： 5 ：55），30 min等度洗脱，检测波长为280 nm，柱温25℃。理论塔板数以苯甲酰新乌头碱色谱峰计算不低于3000，以6-姜酚色谱峰计算不低于5000。各待测组分峰与相邻组分峰可以实现基线分离。娃哈哈纯净水没有色谱干扰峰。苯甲酰类乌头碱与6-姜酚的对照品及样品HPLC色谱图见图1，图2。

2.3 苯甲酰类乌头碱方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取2.1.1项下混合对照品溶液1，10，20，30，40，50 μL（考察苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱线性关系）、苯甲酰乌头原碱单一对照品（0.97 mg·mL-1）1，10，20，30，40，50 μL（考察苯甲酰乌头原碱线性关系）；按2.2项下色谱条件测定，记录峰面积。以对照品量X/μg对色谱峰面积Y进行线性回归，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的回归方程分别为Y =1672.1203X-18.2933，r=0.9998；Y =1374.3765X-2.9016，r=0.9998；Y =1467.3624X-5.4255，r=0.9999；线性范围分别为0.095～4.75 μg，0.97～48.5 μg，0.06～2.75 μg。

2.3.2 精密度试验 取2.1.1项下混合对照品溶液10 μL，按2.2项下苯甲酰类乌头碱的色谱条件测定，连续进样6次，测定峰面积，计算苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD分别为0.91%、0.52%和0.52%。结果表明精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取2.1.2项下传统法制备的四逆汤溶液6份，每份10 mL，按2.1.3项下苯甲酰类乌头碱的HPLC供试液处理方法操作，按2.2项下苯甲酰类乌头碱的色谱条件测得苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量平均值分别为44 μg·mL-1、104 μg·mL-1 、20 μg·mL-1；RSD分别为1.65%、1.44%、2.37%。结果表明重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取2.1.3项下苯甲酰类乌头碱传统法HPLC供试品溶液，按2.2项下苯甲酰类乌头碱的色谱条件测定，于室温下在不同时间点（0，4，8，12，16，20，24 h）进行测定，3种苯甲酰乌头碱类成分RSD分别为1.48%、1.19%、1.31%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取2.1.2项下传统法制备的四逆汤6份，每份5 mL（苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量分别为44 μg·mL-1、104 μg·mL-1 、20 μg·mL-1），分别精密加入苯甲酰新乌头原碱对照品溶液230 μL （0.95 mg·mL-1）、苯甲酰乌头原碱对照品溶液540μL（0.97mg·mL-1 ）、苯甲酰新乌头原碱对照品溶液90μL（1.1 mg·mL-1），按2.1.3项下操作制备苯甲酰类乌头碱HPLC供试液，按2.2项下苯甲酰类乌头碱的色谱条件测定，外标法测定其含量，计算3种苯甲酰乌头碱的平均加样回收率（n=6）分别为98.4%、99.8%、98.8%。RSD分别为1.8%、0.3%、1.6%。结果见表1。

2.4 6-姜酚方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取2.1.1项下6-姜酚对照品溶液（70 μg·mL-1） 1，5，10，15，20 μl，按2.2项下6-姜酚色谱条件测定，记录峰面积。以对照品量X （μg）对色谱峰面积Y进行线性回归，结果6-姜酚的线性回归方程Y =47.24X- 4.531，r =1.0000。线性范围为0.07～1.40 μg。

2.4.2 精密度试验 分别取2.1.1项下6-姜酚对照品溶液（0.7 mg·mL-1）10 μL，按2.2项下6-姜酚色谱条件测定，连续进样6次，测定峰面积，计算6-姜酚峰面积的RSD为0.09%，表明精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取2.1.2项下传统法制备的四逆汤溶液6份，每份5 mL，按2.1.3项下6-姜酚的HPLC供试液处理方法操作，按2.2项下6-姜酚的色谱条件测得6-姜酚的平均含量为48 μg·mL-1；RSD为0.37%。结果表明重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取2.1.3项下6-姜酚传统法HPLC供试品溶液，按2.2项下6-姜酚的色谱条件测定，于室温下在不同时间点（0，4，8，12，16，20，24 h）进行测定，结果6-姜酚峰面积的RSD为0.15%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验 取2.1.2项下传统法制备的四逆汤6份，每份2.5 mL（已知6-姜酚含量为48 μg·mL-1），加入6-姜酚对照品溶液170 μL（0.7 mg·mL-1），按2.1.3项下操作制备6-姜酚HPLC供试液，按2.2项下6-姜酚的色谱条件测定分析，结果6-姜酚的平均回收率（n=6）为99.9%，RSD为1.2%。结果见表1。

2.5 样品测定

取2.1.3项下苯甲酰类乌头碱及6-姜酚的复方供试品溶液1～6，按2.2项下色谱条件测定。分别计算供试品溶液中苯甲酰类乌头碱、6-姜酚的含量。结果见图1～2和表2。3种方法提取液中甘草苷、甘草酸的含量由课题组研究人员测定[9]。）

2.6 数据分析

四逆汤中有效成分较多且含量差异较大，不宜将多个指标成分含量直接加和来比较提取方法的优劣。故将表2中的数据，按照计算公式（1）进行z-score标准化（normalization）处理，以消除各指标变量单位和量纲不同及范围相差悬殊造成的影响[10]。标准化处理后结果见表2。

3 小结与讨论

本实验建立四逆汤复方提取液中苯甲酰类乌头碱、6-姜酚的HPLC测定方法，比较3种不同提取方法即传统法、药典法、有效部位组合法所制备的提取液中指标成分的含量。结果发现有效部位组合法对复方中苯甲酰类乌头碱的提取效率较高。

传统提取法多为群药合煎，存在部分有效成分提取率低的缺点；药典法制备过程涉及水提醇沉，会造成成分损失。本实验在查阅相关文献的基础上，根据各单味药所含成分的化学性质，对黑附子中生物碱采用酸水提取[4]，炙甘草甘草酸和甘草苷成分采用氨醇提取[5]，干姜挥发油水蒸气蒸馏提取[6]，结果发现3种苯甲酰类乌头碱成分含量较前2种提取方法高。这说明黑附子酸水提取更有利于生物碱类成分的溶出。推测传统提取法和药典提取法中附子和甘草混煎，可能甘草中黄酮类成分与附子中生物碱发生沉淀反应，致使附子生物碱类成分、甘草酸类成分含量较有效部位组合法偏低。

本节实验采用z-score标准化方法，这是基于原始数据的均值（mean）和标准差（standard deviation）进行数

据的标准化，可以消除指标成分之间含量范围相差悬殊对综合结果造成的影响。标准化结果显示有效部位组合液中除6-姜酚略低于平均水平，其余5个指标成分均高于平均水平，而传统法及药典法制备的四逆汤标准化的数据除6-姜酚，其余均低于平均水平；综合评定，以有效成分提取量计，有效部位组合法提取效果最好，这为四逆汤提取工艺的优化提供理论指导。

参考文献

[1] Li X.Research of the chemical composition of Sini decoction and its anti-ischemic effect [J]. Doctoral dissertation of the school of pharmacy，second military medical university.2008.

[2] He J， Fang Y W， Li Y M， eta. The protective effect of Sini decoction of anti-ischemic injury [J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine， 2008， 23（7）： 638-640.

[3] Wu W K，Su J W，Lin S G，ela.Clinical Study on Therapeutic Mechanism of Sini Decoction in Treating Post-Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty Ischemia-Reperfusion Injury in Terms of Syndrome Typing of TCM [J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，1999，（19）：23-25.

[4] Wang L Y，Zhang D F，Qu X B . The study of cardiac function of effective parts in aconite before and after process [J] ， Chinese journal of traditional Chinese medicine. 2008，（34）：35-38.

[5] Huang X S，Yan R A，Wu J Z. A review of the biological activity of the gingerol [J]. Journal of Jinan University（Natural Science & Medicine Edition），2005， 26（ 3） ： 434-439.

[6] Li S H，Chen F Z， Huang X H， eta.The study of aconite alkaloids orthogonal extraction process and adsorption resin screening in Fuzi [J].（ Journal of traditional Chinese Medicine， 2010，（8）： 1419-1421.

[7] Zhao W L，Shi Q Z，Tang X， eta.The study of licorice licorice acid and liquiritin of the extraction and purification [J]. Chinese Pharmacy， 2009， 20（6）： 426-428.

[8] Kong W J，Zhao Y L，Shan L M， eta.l Byorthogonal volatile oil extraction [J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae， 2009， 15（3）： 19-20

[9] Wang X L，Gong L L，Rong R， eta.l Determination of radix ，glycyrrhizic glycyrrhizae in Sini decoction by three methods of Sini Decoction. [J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae.2012，18（6）：71-74

[10] Zhang C H，Yan Y L. Mathematical Statistics in Medicine [M]. Beijing：Science Press，2001：212.