线蛱蝶亚科蝶类部分类群线粒体COI基因的分子系统发生分析

摘 要：以线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因作分子标记，对线蛱蝶亚科蝴蝶进行序列测定，序列分析的结果表明，经比对和处理后的序列总长度是645 bp，其中有199个变异位点，147个简约信息位点；所编码的氨基酸序列中有18个变异位点，7个信息位点，A+T平均含量为69.6％，G+c平均含量为30.4％，碱基组成出现AT偏斜，以蛱蝶亚科及秀蛱蝶亚科物种为外类群，用NJ、MP及贝叶斯法重建了该亚科的系统发生树，探讨了它们主要类群间的系统发生关系，分子系统树显示，线蛱蝶亚科由以下3大支系：环蛱蝶族+翠蛱蝶族、线蛱蝶族、丽蛱蝶族构成；其中，环蛱蝶族为单系群(NJ树也支持线蛱蝶族的单系性)；翠蛱蝶族与环蛱蝶族亲缘关系较近：丽蛱蝶族可能是该亚科较早分化出的一支。

关键词：蛱蝶科；线蛱蝶亚科；COI，基因；分子系统发生

中图分类号：Q969.42

文献标识码：A

文章编号：1007.7847(2007)01-0064-08

线蛱蝶亚科(Limenitinae)隶属于鳞翅目(Lepidoptera)蛱蝶科(Nymphalidae)，1864年由Behr建立，是蛱蝶科中较大的亚科之一，多数为中型或大型种类，主要分布在东洋区、新北区、古北区、新热带区、埃塞俄比亚区及澳洲区，按最新的分类研究结果，全世界共有46个属808种左右，中国有其中的18个属共114个种，主要分布于我国南方的广大地区，和大多数蝶类一样，该亚科的形态学分类问题一直存在着争议，不同的研究者认为它们可能是一个多系群或并系群，线蛱蝶亚科的分子系统学等方面的研究在我国还是空白，国外的相关研究也十分少见，

蝶类所蕴含的多样性信息在无脊椎动物中是十分丰富的，并一直作为进化生物学和生态学研究的模型系统之一，随着分子生物学的迅速发展，多种DNA分析方法被用来研究不同类群、物种和种群间的遗传差异，其中线粒体基因是常用的目的基因，近十几年来，许多学者利用mtDNA(mitochondrial DNA)基因对昆虫纲内不同分类阶元之间系统发育关系进行了大量的研究，这些研究中所选取的目的基因，其中COI(cytochromeoxidase subnit I)基因的应用频率是较多的，目前，运用该基因研究蝶类的系统发生关系已有一些报导。

本研究测定了线蛱蝶亚科7属18种的线粒体COI基因部分序列，并从GenBank下载了该亚科4属4种的同源序列片段，通过该基因的比较和分析，重建该亚科的分子系统树，并据此探讨了该亚科的系统发生关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用昆虫标本均为2005年采集的新鲜标本，样品采集后立即放入75％酒精中固定，带回实验室后放入-20℃冰箱保存，材料来源和时间见表1。

1.2 基因组DNA的提取与扩增

采用蛋白酶K-玻璃粉法提取和纯化基因组DNA，具体方法参照Hao　et al，合成后生动物COI基因的一对通用引物，序列为：

L1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′；

H2198：5′-TAAACTYCAGGGTGACCAAAAAAT-3′，

该引物可特异扩增mt DNA的COI基因(约650 bp)片断，引物合成由上海生物技术有限公司完成。

PCR反应的总体积为50IxL，反应体系包括：10×buffer 5.0μL，25mmol/L的MgC12 7.0μL，0.2g/L的BSA 5.0IxL，0.25mmol/L的dNTPs1.25μL，10μmol/L引物各1.5μL，1.0U Taq酶及2μL(含10－25ng DNA)模板溶液，扩增条件为：94℃预变性5min，按下列参数进行35个循环：94变性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min 30s，最后一个循环结束后，72℃总延伸10min，PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，经纯化试剂盒纯化后，在ABI-377型测序仪上直接测序(由大连宝生物工程有限公司完成)。

1.3 DNA序列数据处理及分子系统树的重建

对本研究测定了线蛱蝶亚科的18个种，并从GenBank上下载了该亚科4种、秀蛱蝶族2种及蛱蝶亚科一种的COI相应序列片断见表1，用Clustal X(1.8)软件该基因序列及氨基酸序列进行比对，基于Kimura-2－parameter模型，采用分子进化遗传分析软件Mega3.1计算不同序列间的可变位点、简约信息位点、转换颠换比值、对遗传距离及各碱基含量，由软件DAMBE分析序列间的不同特质，如不同密码子位点的转换与颠换比及转换、颠换和遗传距离之间的关系。

用Mega3.1邻接法构建NJ树及Paup4.0b10最大简约法构建MP树，对NJ树和MP树分别进行了内部分支检验与1000次bootstrap检验分析，来确定各支系的置信度，用MrBayes2.01构建贝叶斯树，替换模型参数设置为nst=6(GTR模型)位点间速率设置为retes=gamma，建立4个马尔科夫链，以随机树为起始树，共运行200000代，每100抽样一次，重复一次，在舍弃老化样本后，根据剩余的样本构建一致树，将所得结果进行统计，获得系统树的支系结构以及各支系的后验概率。

2 结果

2.1 COI基因序列组成及变异

共测定了蛱蝶科线蛱蝶亚科3个族18个种的线粒体COI基因的部分序列，已提交Gen-Bank，登陆号见表1，所选外类群为蛱蝶亚科的枯叶蛱蝶。秀蛱蝶亚科的电蛱蝶和素饰蛱蝶，本研究所测序列与GenBank中下载的4种线蛱蝶亚科蝶类的同源序列进行比对并处理后的总长度为645bp，其中有199个可变位点，147个信息位点，各碱基的平均含量及3个不同密码子位点的变异及信息位点数比较见表2，从表2可以看出，该基因表现出明显的A+T含量(平均69.6％)偏斜，就每个氨基酸密码子来看，碱基组成在不同位点差异很大，第3位点的A+T含量很高，达到92.5％。

用MEGA软件对线蛱蝶亚科物种的氨基酸组成进行分析，在645 bp的核苷酸序列所编码的215个氨基酸中，有18个变异位点，7个信息位点，其中环蛱蝶族与其它几个族区别稍多，在116位点，环蛱蝶族与其它族不同，在95位点，环蛱蝶族与拟缕蛱蝶相同为苏氨酸，而其它均为天冬氨酸；114位点上，环蛱蝶族与翠蛱蝶族相同，线蛱蝶族中的回线蛱蝶和重眉线蛱蝶的氨基酸与秀蛱蝶族相同，另外有3个物种的氨基酸变异数目相对较多，分别是回线蛱蝶、丽蛱蝶及拟缕蛱蝶。

统计两两序列间碱基替换数和遗传距离之间

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的关系见图1，平均转换／颠换比接近1，分析发现，大部分序列第3密码子位点的转换／颠换比小于1，表明转换在此位点已达饱和，这与以前的一些研究是相似的，这种现象提示高水平的平行演化现象的发生，将第3密码子除去，第1和第2密码子的转换／颠换比则超过1(平均5.397)，对于这种现象的处理，一些研究者们建议将第3密码子去除，或进行加权分析，分别对转换和颠换赋予不同的权重，本文为了估计COI第3密码子的转换的高饱和率在线蛱蝶亚科系统发育分析中的影响，将第3密码子去除与保留该位点进行比较分析，遗传距离在内群和外群之间的最大值为16.3％，最小为12.1％，内群序列间的平均遗传距离为10.8％。

图1看出当遗传距离较小时，转换的数值(Ts)明显高于颠换的数值(Tv)，随着遗传距离(p)的增加，转换的数目会暂时处于一个较为恒定的状态(达到饱和)，而颠换数呈持续上升趋势(超过转换值)，从而导致转换颠换比值明显下降，当遗传距离增加很大时，转换数又开始增加，总之，本研究的Tv、Ts和p值之间呈现出良好的线性关系。

2.2分子系统树

本研究共构建了4种树：NJ(Neighbor-ioining)树、贝叶斯树(bayesian tree)、MP(Maximum parsi-nomy)树及去除密码子第3位点的MP树，构建的NJ树如图2，贝叶斯树如图3所示；由于第3密码子位点的转换出现了饱和，因此，构建了全部位点的MP树(TL=572，CI=0.4930，RI=0.6033)和去除第3密码子的MP树(TL=94，CI=0.5319，RI=0.7067)，但这两种树拓扑结构非常相似(限于篇幅，本文未显示)，NJ树和这两种MP树的拓扑结构也很相似，主要差别在于拟缕蛱蝶和细刺栎蛱蝶的位置有所不同，对这4种树进行综合比较，以NJ树为例，可将内群分为3个支系：第1个支系由丽蛱蝶族的丽蛱蝶组成；第2个支系由线蛱蝶族线蛱蝶属、悌蛱蝶属、带蛱蝶属和拟缕蛱蝶属相聚而成，其中，带蛱蝶属和悌蛱蝶聚成一簇，线蛱蝶属聚成一簇(上述2簇互为姊妹群)，它们聚类后再和拟缕蛱蝶属聚在一起；第3个支系包括翠蛱蝶族的翠蛱蝶属、栎蛱蝶属以及环蛱蝶族的环蛱蝶属和裴蛱蝶属，其中，几种环蛱蝶类聚成一簇(菲蛱蝶位于其内)，几种翠蛱蝶聚成一簇，而栎蛱蝶和以上2个聚类簇构成该支系的3个小支系。

3 讨论

3.1 COI基因序列

通过对所测得的COI基因部分序列进行分析，结果表明，A、G、C和T的碱基平均含量分别为29.6％、14.7％、15.7％和40.0％，A+T平均含量为69.6％，C+C平均含量为30.4％，与其他文献报道的昆虫线粒体基因组的结果较为一致，贝叶斯法的分析结果表明，在6种碱基替换类型中，C和T间的替换速率最高，其次是A和C，A和G间替换，Mega软件所分析的序列数据组的平均转换／颠换比值为0.958，即颠换值比转换值平均要高，之所以会出现这种结果，可能有以下几种原因：首先，某些位点发生了多次转换替代(替代饱和)，然而，越来越多的研究表明，饱和问题并不是在进行简约性分析时推导系统发育关系的障碍，其次，Crozier等(1992)认为高A+T含量与氨基酸序列变异没有显著的相关性，但一些学者却认为高A+T含量会增加AT颠换的可能性，因而导致第3位点颠换速率增加，本研究中，翠蛱蝶族及线蛱蝶族物种的平均A+T含量分别为70.2％和69.8％，第3位点A+T为94.2％，94.7％，均高于所有类群平均含量，而环蛱蝶族则相对较低；从单个物种来看，之前分析的氨基酸变异较多的拟缕蛱蝶及回环蛱蝶的A+T含量并不是很高，只有丽蛱蝶较高，因而我们支持Crozier等的观点。

3.2 线蛱蝶亚科是否可以作为一个独立的亚科

近年来国外的生物学家们对于蝴蝶的系统发育研究越来越多，并据此提出了不同的分类系统，有关线蛱蝶亚科较早的分类是由Harvey(1991)基于幼体形态特征而提出，他认为线蛱蝶亚科是一个“非自然”的集合，是一个多系群；Ackery等(1999)也持有相同的观点。

他们将线蛱蝶亚科划分为5个族，包括线蛱蝶族、朱履蛱蝶族Biblidini、丝蛱蝶族Cyrestini、秀蛱蝶族Pseudergolini及黄肱蛱蝶族Coeini，其中的线蛱蝶族即本文研究的线蛱蝶亚科，随后，Fre－itas(1999)基于成体和形态学特征得出了不同的结论：将朱履蛱蝶族从线蛱蝶中分开，而将黄肱蛱蝶族则纳入蛱蝶亚科，随着分子系统学在蝶类的系统分类研究中的运用，蛱蝶类的相关研究取得了一些新的进展，Brower(2000)基于wingless基因的研究结果显示朱履蛱蝶族与蛱蝶亚科的关系比较接近；最近的研究也表明朱履蛱蝶族、丝蛱蝶族、秀蛱蝶族及黄肱蛱蝶族都应从线蛱蝶亚科中分离出来；Wahlberg等(2003)的研究进一步建议将丝蛱蝶族和秀蛱蝶族合并为丝蛱蝶亚科；周尧(1998)的分类系统也将上述4族与线蛱蝶亚科分开，综合形态学及最新的分子证据，我们认为Harvey(1991)分类中的线蛱蝶族应该脱离出来以一个独立的亚科而存在，即线蛱蝶亚科。

3.3 线蛱蝶亚科内的系统发育

本研究中共包括线蛱蝶亚科4个族，这些族的划分及所包含的属是基于形态特征划分的，在这4个族中，有3个族所选用的标本包括2个或2个以上属，分子系统树上这几个族所含种类基本上分别聚在一起，形成单元族，只有栎蛱蝶属、缕蛱蝶属的位置在几颗系统树上并不一致。

上述4族中，环蛱蝶族在早期是独立于线蛱蝶亚科之外的，Eliot(1978)和Amiet(2000b)也认为应将环蛱蝶族从线蛱蝶亚科中分离出来，然而Willmott(2003)的研究结果还是支持将其纳入线蛱蝶亚科，本研究中仍将该族置于线蛱蝶亚科中，结果显示该族的物种相聚在一起，并且有较高的自展值和后验概率的支持，其中，该族菲蛱蝶属的柱菲蛱蝶位于环蛱蝶属物种的中间，表明这两个属有非常近的亲缘关系，从形态学上来看，2者的主要差别在于：柱菲蛱蝶的翅面斑纹白色，中室条纹与侧条及横带下段不愈合；而环蛱蝶属的翅正面黑色，有淡色斑纹，除前翅中室纵条纹外，前后翅的斑纹连成2重的环，但其他的形态性状较为相似，因此也有学者将菲蛱蝶属归入环蛱蝶属，因而笔者也倾向于支持将菲蛱蝶属纳入环蛱蝶属，关于翠蛱蝶族，Amiet(2000a)通过对该族形态学共源性状的研究，认为它们应该为一个单系群，而本研究结果显示：NJ系统树上，其中的栎蛱蝶属为翠蛱蝶属3个种类的旁系群，而包含第3密码子的MP树上该属与翠蛱蝶属关系则较远，从遗传距离上来看，细刺栎蛱蝶与翠

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蛱蝶属物种及其它属物种间的遗传距离差别不是很大，因而我们的结果并不支持他的观点。

线蛱蝶族自建立以来，其分类地位一直没有多大变动，该族是一个较大的类群，它的单系性似乎是毋庸质疑的，在本研究所构建的NJ树上，该族的四个属聚在一起形成单系群，而在贝叶斯树上拟缕蛱蝶与环蛱蝶族的关系较接近，从氨基酸序列分析来看，拟缕蛱蝶在某些变异位点上与环蛱蝶族更为相似，缕蛱蝶属为我国特有的属，在Harvey(1991)的分类系统中是放在线蛱蝶属中的，而周尧(1998)则将它从线蛱蝶属中分开，从遗传距离来看，线蛱蝶属内物种间的遗传距离在0.039与0.068之间，而拟缕蛱蝶与线蛱蝶属的最小遗传距离是0.127，NJ树上它与线蛱蝶族其它类群相聚的自展值也较小，因而笔者倾向于将缕蛱蝶属从线蛱蝶族中独立出来，带蛱蝶属的玉杵带蛱蝶和幸福带蛱蝶两者的COI基因变异位点不超过2个，遗传距离很小(0.002)，形态上它们的关键区别特征是：玉杵带蛱蝶前翅近顶端有3个白色小斑，中横带与外横带不接触，而幸福带蛱蝶前翅近顶端有2个白色小斑，中横带与外横带在前缘相连，两者的形态区别似乎又可以将它们划分开来，而且幸福带蛱蝶为我国特有种，是否可以将它们合为一种，尚期待更多的基因与形态学的联合分析，值得一提的是，本文来自海南的相思带蛱蝶则与线蛱蝶属聚在了一起，从形态上来看，这两个属也是很相似的，可否将其归入线蛱蝶属还值得进一步探讨，目前，一些学者也逐渐地将表现型独特的物种从线蛱蝶属中移走，如回线蛱蝶和重眉线蛱蝶等，他们认为该属可能是并系的，从我们的研究看，回线蛱蝶的氨基酸变异位点相对较多，分子系统树上也显示回线蛱蝶和重眉线蛱蝶与其他线蛱蝶相对距离较远，总之，该族的系统学研究还需要大量的分类单元和不同基因数据的介入。

Willmott(2003)的形态学分支分析结果认为丽蛱蝶族是线蛱蝶亚科中最早分化出来的类群，其次是环蛱蝶族，本研究结果显示，丽蛱蝶族的位置基本上是处于系统树的基部，是该亚科较早分化出来的类群，而线蛱蝶族早于环蛱蝶族从该亚科中分化出来，环蛱蝶族与翠蛱蝶族则可能是较晚分化的类群。

致谢：西北师范大学龚大杰教授协助采集部分标本，在此深表谢意！

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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