痰涂片阴性肺结核的诊断进展

痰涂片阴性肺结核(PTB)的诊断一直困扰着广大医疗工作者，目前临床采用的诊断方法普遍存在敏感性和特异性不高、耗时太长、可操作性差、造价太高等问题。寻找一种特异、准确、快速、简捷的诊断方法是所有医疗工作者的目标和希望。

1、痰涂片阴性PTB

痰涂片阴性PTB是指患者可以具有PTB的临床表现和胸部X光片异常，但是经反复痰涂片镜检检查为阴性。痰涂片阴性PTB往往见于结核病变的早期或病变吸收好转过程中，病理上大多以渗出、增殖、纤维化甚至钙化为主的病灶，临床症状大多较轻，甚至没有症状。普通痰涂片法诊断结核阳性率较低，只有30％－50％。更为严重的是，HIV(+)/AIDS患者也是结核的易感人群，AIDS流行区结核病例呈3倍增加，增加的几乎都是痰涂片阴性的病例。据统计，全球已有150万HIV(+)／MDS患者合并结核感染，以至于有人呼吁把HIV感染和严重的AIDS纳入到痰涂片阴性PTB的国际性诊断指标中来。

2、痰涂片阴性PTB的诊断现况

2.1细菌学诊断

2.1.1 痰常规培养 目前国际上普遍采用的经典痰培养法是改良罗氏培养法(L－J固体培养基)，标本采用谷氨酸钠等无机盐、甘油和新鲜鸡卵液混匀装入灭菌的标准培养管，经4℃保存1个月内可供培养使用。另外一种酸性罗氏培养基是将磷酸二氢钾从原来的2.4 g增加至14 g，其他成分和制备菌方法与改良罗氏培养基相同。培养的灵敏性为10－100个细菌/ml痰液才能得到阳性结果。虽然部分提高了诊断阳性率，但培养时间较长，约4－8周，不能满足临床需要，也只能供参考和主要用以指导用药，判断治疗是否失败及疾病是否复发。另外，上述培养法的高级设备和专门技术要求也使其实用性大大受限，多在一些发达国家推荐使用。PTB传播最新研究发现，涂阳的PTB才是主要传染源，痰涂片阴性、培养阳性的病例传染性很小。但是痰涂片阴性活动性PTB患者也有传染性，而且占半数以上的痰涂片阴性患者中仍有不低于17％的人是传染源或很快成为新的传染源。

2.1.2 Bactec MGIT－460和MGIT－960 TB检测系统结核杆菌生长培养管(mycobacter grow incubatortube，MGIT)－460检测系统的原理是将标本接种于含有“C－棕榈酸的7H12B培养基，37℃培养，分支杆菌C－棕榈，产生CO2，用Bactec－460TB仪自动检测CO2含量，并换算成生长指数(GI)值，然后对GI值进行分析报告。MGIT－960的原理是，在含有Middebrook7H9液体培养管中，用硅树脂将荧光指示剂包埋在管底部，并将指示剂与培养基隔开，而此硅树脂只允许O,2通过，水不能通过。培养基中有分枝杆菌生长时，氧分子被消耗，培养基的氧化还原电势降低，指示剂则发荧光，在波长365 nm的紫外光观察，有荧光出现者判为阳性结果。这两种是最新研究的方法，培养培养时间大大缩短，大约两周时间，敏感性也有较大提高。MGIT－960 TB检测系统平均检出结核分枝杆菌生长的时间缩短到8－16天。两种方法相比较，前者底物有放射性物质，易污染环境，后者则无，两者培养时间和敏感性相当。痰涂片阴性病例的结核分枝杆菌检出时间要比涂阳病例适当延长。

2.1.3 血培养包括儿童在内的许多活动性结核并HIV感染病人可以培养出结核分枝杆菌。然而，血培养仅推荐在血行播散型结核并HIV(+)病例中作为一种辅助诊断工具使用。

2.2 影像学诊断影像学检查是PTB的主要诊断手段之一，是发现肺门病灶、纵隔淋巴结结核、胸膜炎、心包炎等不可缺少的手段。但是，痰涂片阴性PTB胸片表现多不典型。痰涂片阴性病人比涂阳病人在胸片上有空洞的情况少，可能说明初治涂阴病人肺部病理改变范围小于初治涂阳病人。HIV感染的结核病人比无HIV感染的结核病人更可能有非典型胸片表现，在HIV、结核高流行区，75％的痰涂片阴性PTB病人胸片表现不典型。有研究显示，痰涂片阴性、胸片正常或轻微异常的疑似结核病人21％的用培养证实为PTB，47％的3个月后发展为典型的放射学表现，1/3的痰培养阴性病人随访期间也发展为典型的放射学表现。CT诊断的准确率明显高于胸片，这一点在国内有相关报道：CT正确诊断率为63.8％，优于平片的29.8％(P

2.3免疫学诊断方法

2.3.1 结核菌素试验(OT试验) 结核菌素试验是非纯化抗原，含有与卡介苗(BCG)及其他分支杆菌共有的多种抗原成分。旧结核菌素试验因为具有假阳性率高，极不易标准化等缺点，已经基本被淘汰。现在主要采用的结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)，也在多方面存在局限性。这种皮肤试验的重要缺陷是常常是在接种了BCG却未接触结核分枝杆菌的个体产生阳性结果。而这种假阳性的最合理的解释是，淋巴细胞通过血液和皮肤而不是肺组织对BCG产生了特异的记忆。另外，对老年活动性结核病患者，免疫抑制剂使用者，HIV(+)／AIDS并发结核患者，阳性率较低。因此，PPD试验除对儿童结核病，尤其未接种BCG的有诊断价值以外，对其他结核，特异性和敏感性差，已不用作诊断结核病的指标。

2.3.2 结核特异性抗体结核特异性抗体常检测血清中的38 kD蛋白抗原。38 kD蛋白抗原是结核病血清诊断中采用最广泛的抗原，抗38抗体和高菌负荷相关联，涂阳结核病患者阳性率49％－87％，而涂阴患者则低得很多。有麻风结节的麻风病患者也能检测出相应的抗38 kD抗体，出现假阳性，用于痰涂片阴性患者诊断的价值不大。

2.3.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 1976年Naussau首次用ELISA法检测结核患者血清中的抗结核抗体以来，ELISA法在结核病学研究中得到广泛应用。人们也一直寄希望于这种简单、易行、快速的诊断方法能对痰涂片阴性或菌阴PTB的诊断提供有参考价值、有意义的信息。但结果不十分令人满意，难以满足临床需要。

2.4分子生物学诊断技术

2.4.1聚合酶链反应(PCR)PCR是由一对特定寡核苷酸引物介导的检测结核分枝杆菌核酸异的序列片段的体外酶促扩增技术。经过不断改良与研究，PCR技术对痰涂片阴性标本保证特异性95％以上的条件下可提供50％的阳性率，有助于临床诊断。国外1995－2004年间63篇文章报道了采用不同商品试剂盒的核酸扩增检测法(NAATs)对痰涂阴标本的诊断敏感性和特异性分别为66％和98％。曾经有人对这些文献的数据进行了两项NAATs诊断结核准确度分析发现，研究者的试验方法不同会出现诊断敏感性和特异性的差异，研究设计方法和

质量不同也会出现诊断敏感性和特异性的差异。另外，分析数据还表明经纤维支气管镜获取的标本诊断准确率有所升高。

2.4.2 连接酶链反应连接酶链反应采用热稳定连接酶区分DNA序列上仅有一个碱基对的差异。尽管没有PCR的高度敏感性，但连接酶链反应具有高识别能力，对于涂片阳性和阴性的标本具有较高的灵敏度。是有用的结核病初筛检验方法，为早期诊断提供了一种快速鉴别方法，也补充了传统的涂片及培养的微生物诊断技术。

2.4.3 链置换扩增链置换扩增(strand displacement am－plification，SDA)技术利用某些限制酶能在其半修饰点形成单链切口的特性，某些聚合酶的链置换能力和特殊设计的引物的有序引导来实现核酸的恒温扩增。SDA的过程可以分为从待扩增核酸形成SDA扩增子与SDA扩增子的链置换扩增两个阶段。SDA技术用于检测结核杆菌、鸟分支杆菌和堪萨斯分支杆菌，只需进行一个简单的两步反应测试就可以检测和鉴定涂片阳性的标本中两种最常见的抗酸杆菌：结核分支杆菌和鸟分支杆菌。

2.5纤维支气管镜检查纤维支气管镜检查对痰涂片阴性PTB和菌阴PTB的诊断具有重要价值，对无痰少痰的病例意义更大。纤维支气管镜检查及通过纤维支气管镜吸取分泌物、刷检、活检以及支气管肺泡灌洗液(BALF)检查常可提供病理学及细菌学依据。常规纾支镜检查基础上(刷检、活检)，再行支气管肺泡灌洗，对BALF进行离心、沉淀，而后涂片、培养查结核杆菌。但是刷检、活检的阳性率很低，国内报道只有10％－20％，难以满足临床要求。

2.6胸液、胸膜、肺活检痰涂片阴性PTB如果伴有胸腔积液，可以进行胸膜腔穿刺收集胸液查结核杆菌，也可用胸膜穿刺活检术。目前多采用Tru―Cut和Vacu―Cut细针在超声或CT引导下进行胸膜活检，有并发症少、准确率和诊断率好等特点。肺穿刺活检因创伤和并发症等原因，一般在上述方法未能确诊者采用。成功率和诊断价值与操作技术直接相关。

2.7实验性诊断性治疗 国内文献报道，痰涂片阴性PTB如不及时治疗，约41％的病人在5年内痰菌可能转为阳性，成为传染源。由于上述方法未检出结核杆菌或医疗条件限制或患者自身原因，痰涂片阴性PTB多采用诊断性治疗以达到及时治疗，“投石问路”的诊断目的。理论上，治疗方案中最好不含有对其他病原菌也有抗菌活性的药物如氨基糖苷类、利福类、喹诺酮类等，以免发生误导。

3、痰涂片阴性PTB的诊断新方法

从BALF中分离表达IFN-γ这是英国学者Breen等报道的针对痰涂片阴性PTB的最新方法。研究者从大批痰涂片阴性临床诊断符合活动性PTB的病人中收集BALF，从中分离CD45和CD4 T细胞，经PPD刺激，测定产生的IFN－γ的百分比。检测结果以大于1.5％定为阳性。报道还表明，对BAL涂阴的活动性结核病例的检出率未减低，在低菌患者和轻微肺疾病患者中BALF免疫检测显示出明显优势。这与其他分子生物学技术的应用受到限制形成鲜明对比。英国另一位学者对这种方法给予了高度评价，认为对临床怀疑结核但是痰涂片阴性的BALF局部免疫诊断非常值得研究的方法。这种局部免疫反应检测法比外周血免疫反应检测显示出很大潜力。但这种方法仍然有较高的假阳性率(24％)，这可能是这种方法存在的一个大问题。

BALF中检测IFN－1表达是针对痰涂片阴性PTB的一种全新的局部免疫检测方法，在国内尚未见到相关报道。根据作者的研究结果，这种方法有很高的敏感性和很好的可操作性，是一种具有巨大潜力的研究方法。然而，这种局部免疫检测仍然存在有特异性不高的问题。因此，还有待于进一步对这种方法进行验证和改进，使它成为痰涂片阴性PTB诊断的强有力武器。