大鼠正畸牙压力侧牙周膜中RANKL、OPG的表达

摘要：目的：探查大鼠正畸牙压力侧牙周膜中RANKL、OPG的表达特点。

方法：清洁级SD雄性大鼠120只，随机分为正畸加力组和空白对照组。在实验开始后第1、3、5、7、10、14天分批处死，免疫组织化学检测RANKL和OPG的表达，TRAP染色检测破骨细胞。

结果：在正畸力的作用下，RANKL的表达和破骨细胞的数目随着实验时间逐渐增加，在第5天时达到顶峰随后逐渐下降；OPG的表达随着实验时间逐渐增加，在第7天时达到顶峰随后逐渐下降。

结论：大鼠正畸牙压力侧牙周膜中RANKL与OPG的变化不同步，RANKL较OPG提前达到表达高峰。

关键词：RANKL OPG 正畸牙 破骨细胞

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0057-03

RANKL/OPG系统作为破骨细胞形成不可或缺的一环，在骨形成与骨吸收的平衡中发挥着重要作用[1]。本实验通过建立大鼠正畸牙移动模型，应用免疫组化技术检测正畸牙压力侧牙周膜中RANKL、OPG的变化，初步探讨RANKL及OPG在正畸过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物。清洁级SD雄性大鼠120只，6～8周龄，体重180～200g，大鼠有专人饲养，室内温度保持在25℃左右，湿度50%左右。大鼠自由饮水、进食。适应性喂养1周后进行实验。将120只大鼠随机分为正畸加力组和空白对照组。在实验开始后第1、3、5、7、10、14天通过过量麻醉分批处死大鼠，每组每次10只。

1.2 主要试剂。RANKL（N-19）：sc-7628（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.）、OPG（N-20）：sc-8468（SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.）、山羊超敏二步法免疫组化检测试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）、DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 大鼠正畸牙移动模型。使用涡轮机用CD-52F金刚砂车针在大鼠上前牙颈部从牙槽骨一侧钻孔，贯通两颗中切牙颈部以及对侧牙槽骨，并在左上颌第一磨牙的近中邻面颈缘磨出深约0.2mm的沟槽，整个过程用生理盐水冷却。将一根镍钛螺旋拉簧结扎在左上颌第一磨牙和上切牙间，加力值为40g，牵引第一磨牙近中倾斜移动。调磨下颌第一磨牙减小上颌第一磨牙所受咬合力同时防止因上颌第一磨牙近中倾斜移动导致的咬合创伤。所有动物在加力后两天内辅以软食，之后自由摄食。

1.4 牙齿移动距离测量。大鼠正畸牙实验开始时和处死后取模。用体视显微镜测量模型上第一和第二磨牙牙合面近中舌沟间距离，两次测量均由同一人操作，每个标本重复测量三次计算平均值，两均值差值即为该大鼠加力后牙齿移动的距离。

1.5 免疫组化技术检测RANKL和OPG。常规包埋、切片，脱蜡至水，3%H2O2封闭10min，PBS 3×3min，滴加一抗4℃过夜，PBS 3×3min，滴加二抗试剂A 37℃孵育20min，PBS 3×3min，滴加二抗试剂B 37℃孵育20min，PBS 3×3min，滴加DAB镜下显色，PBS 2×3min，苏木素复染2min，自来水洗，1%盐酸酒精分化10s，自来水洗，脱水，透明，封片。

1.6 RANKL、OPG表达的半定量测量。在每张切片的大鼠正畸牙压力侧牙周膜根颈1/3区随机选择10个视野（×400）进行平均光密度值测量，用image-pro plus 6.0图像分析系统对各组牙周组织中RANKL、OPG的免疫组化染色强度进行分析。

1.7 TRAP染色。常规包埋切片，脱蜡至水，固定液中固定30s，去离子水冲洗，水浴加热TRAP染色液至37℃避光孵育1h，去离子水冲洗，苏木素复染2min，自来水冲洗，脱水，透明，封片。

1.8 破骨细胞计数。在每张TRAP染色切片的大鼠正畸牙压力侧根颈1/3区牙槽骨表面随机选择10个视野（×400）进行TRAP染色阳性（酒红色）细胞计数。

1.9 统计学方法。数据以均数加减标准差（X±S）表示，用SPSS21.0分析软件对正畸加力组和空白组的RANKL和OPG免疫组化染色强度以及破骨细胞计数进行独立样本t检验分析，以P

2 实验结果

2.1 大鼠正畸牙移动距离。在实验的第1天，大鼠的正畸牙即产生较大位移，而在接下来的几天移动缓慢，一直持续到实验第10天产生了大幅度的牙齿移动直至实验结束。

2.2 RANKL染色。RANKL存在于正常大鼠牙周组织中，主要分布在牙周膜成纤维细胞胞浆中，少量存在于牙槽骨中，呈弱阳性表达（图1a）；大鼠正畸牙压力侧牙周膜中RANKL的染色强度随着实验时间逐渐增强，在第5天时达到顶峰呈强阳性表达（图1b），随后逐渐下降，在第10天时与空白对照组相比已无明显差异。

2.3 OPG染色。OPG存在于正常大鼠牙周组织中，主要分布在牙周膜成纤维细胞胞浆中，少量存在于牙槽骨中，呈弱阳性表达（图2a）；正畸加力组中OPG的染色强度随着实验时间逐渐增强，在第7天时达到顶峰呈强阳性（图2b），随后逐渐下降，在第14天时与空白对照组相比已无明显差异。

2.4 破骨细胞计数。空白对照组中可见零星的破骨细胞，胞浆染色呈酒红色（图3a）；正畸加力组压力侧牙周膜中的破骨细胞数目随着实验时间逐步增加，在第5天时达到顶峰（图3b），随后逐渐下降，在实验第14天时与空白对照组已无明显差异。

3 讨论

与成骨细胞相似，牙周膜细胞通过能够表达RANKL和OPG从而调节破骨细胞的活动[2-4]。从图1a和图2a可以看到，RANKL与OPG在空白对照组中呈弱阳性表达，主要位于牙周膜成纤维细胞胞浆中，结果与Kawamoto的研究一致[5]。在本实验中，OPG的光密度值较RANKL的光密度值上升缓慢，而且比RANKL达到高峰时间晚（表1、表2），提示在实验第3、5天时，RANKL与OPG的比例更利于破骨细胞的形成，在第5天时，RANKL的表达达到高峰，破骨细胞数目也在此时最多（表3），说明两者是同步变化的，这与裘松波[6]、史瑞新[7]等的研究结果一致；在实验第7天时，随着RANKL的表达下降而OPG的表达达到高峰，RANKL与OPG的比例不利于破骨细胞的形成，同时由于OPG不仅可以抑制破骨细胞的终末分化及其激活，更能诱导破骨细胞的凋亡[8]，破骨细胞的数量也随着OPG的升高而减少。但是王威等[9]的研究显示，RANKL、OPG以及破骨细胞的表达高峰均在实验第7天，与我们的数据有较大差异，其原因有待进一步探究。

当牙周膜细胞受到压力时可以持续地分泌RANKL[10]，在本研究中，RANKL在持续表达直至峰值之时才值实验第5天，而此时牙齿的位移并不能导致镍钛拉簧力值的迅速衰减解除牙周膜的受压状态，我们推测由于压力侧的骨吸收使正畸有继续移动的空间，但是由于张力侧的改建速度不及压力侧使得压力侧的牙周膜暂时解除了受压状态，进而使RANKL的分泌减少，同时随着实验时间推移，正畸牙向近中移动引起镍钛拉簧形变缩小，力值迅速衰减而不能使牙周膜受压，最终导致RANKL分泌逐步减少。成熟破骨细胞能够通过自我调节机制诱导INF-β产生从而抑制破骨细胞的分化[11]，同时伴随着RANKL的减少以及OPG的增加，使得破骨细胞的数目及功能下降导致骨吸收减缓甚至停止，机体为达到骨稳态使得OPG的表达上升促成了在实验第7天时的表达高峰，随后由于RANKL及破骨细胞的表达继续下降，OPG也随之下降，直至最后平衡，恢复到加力前的状态。

4 结论

在大鼠正畸牙移动过程中，其压力侧牙周膜中RANKL与OPG的变化不同步，RANKL较OPG提前达到表达高峰。RANKL和OPG的变化反映了大鼠正畸牙移动过程中骨改建的情况，同时调节着破骨细胞的分化与活动，在正畸过程中发挥着重要作用。

参考文献

[1] Yasuhiro Kobayashi，Nobuyuki Udagawa，Naoyuki Takahashi. Action of RANKL and OPG for Osteoclastogenesis [J]. Eukmyotic Gene Expression，2009，19（1）：61-72

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[3] Tomokazu Hasegawa，Takashi Kikuiri，Sadaaki Takeyama. Human periodontal ligament cells derived from deciduous teeth induce osteoclastogenesis in vitro [J]

[4] S.Kawamoto，S.Ejiri，K.Hoshi，et al. Immunolocalization of osteoclast differentiation factor in rat periodontium [J]. Archives of Oral Biology，2002，47（1）：55-58

[5] 裘松波，杨健，谭颖徽.核因子-κB受体活化因子配体在大鼠正畸牙压力侧牙周组织中的表达[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2005，15（2）：76-79

[6] 史瑞新，陈远萍，时函.实验性正畸牙齿移动中RANKL在牙周组织中表达的研究[J].现代口腔医学杂志，2007，21（2）：173-175

[7] Lorenz C. Hofbauer，Sundeep Khosla，Colin R. Dunstan，et al. The roles of osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand in the paracrine regulation of bone resorption [J]. Journal Of Bone And Mineral Research，2000，15（1）：2-12

[8] 王威，王邦康，刘郁.大鼠正畸牙移动压力侧牙槽骨中cath K、RANKL和OPG的表达[J].北京口腔医学，2011，19（4）：194-198

[9] Takenori Kim，Asako Handa a，Junichiro Iida，et al. RANKL expression in rat periodontal ligament subjected to a continuous orthodontic force [J]. Archives of Oral Biology，2007，52（3）：244-250

[10] Hiroshi Takayanagi，Sunhwa Kim，Koichi Matsuo，et al. RANKL maintains bone homeostasis through c-Fos-dependent induction of interferon-beta [J]. Nature，2002，416（6772）：744-749