1个遗传性血小板无力症家系的临床表型及发病机理研究

【摘要】目的 对1个遗传性血小板无力症（GT）家系进行临床特征分析及基因突变检测以探索疾病的发病机制。方法 通过出血病史、家族史、止血和凝血指标检测、血小板聚集实验和流式细胞术检测血小板表面整合素αⅡbβ3表达情况明确1个GT家系的诊断，并用PCR 扩增结合直接测序法分析先证者及家系成员的整合素αⅡb基因和β3基因的所有外显子及其侧翼序列，突变位点经检索SNP数据库及查找相关文献排除多态性可能。结果 1个GT家系先证者血小板计数正常，凝血象正常，血小板对诱导剂ADP反应低下，而对诱导剂瑞斯托霉素反应基本正常；流式细胞术结果显示:先证者1为变异型GT，基因分析共发现1纯合突变:发生在β3基因的突变有2种，分别为1199G>A(400Cys>Tyr)。结论 β3 1199G>A纯合突变是家系1先证者发生GT的原因，这是国内首次报道此位点突变。

【关键词】血小板无力症 整合素GPIIb-IIIa 基因突变 出血

中图分类号：R55文献标识码：A文章编号：1005-0515（2011）1-054-03

血小板无力症（Glanzmann thrombasthenia,GT）是由于血小板膜表面整合素αⅡb/β3质和（或）量的缺陷所导致的一种常染色体隐性遗传性疾病，其特点为患者终身存在出血倾向[1]，患者的血小板对多种生理性诱聚剂反应低下或缺如。编码αⅡb亚基和β3亚基的基因均定位于17q21-23 共260 kb 的区域，二者紧密连锁，αⅡb基因长17.2 kb，含30 个外显子，β3基因长65 kb，含15 个外显子。αⅡb与β3基因突变将导致αⅡb和β3亚基结构异常，使αⅡb/β3复合物合成、转运、表达和（或）功能障碍，引起GT[2]。血小板膜表面糖蛋白αⅡb/β3是血小板表面最丰富的粘附蛋白，它是Ca2＋依赖性异二聚体，在血小板活化后可以结合纤维蛋白原和血管性血友病因子介导血小板的聚集，在正常止血中发挥作用，介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用，它参与了身体中多种生理过程[3]。本次实验主要通过对明确诊断的5例GT先证者及家系突变点筛查，并探索其可能的发病机理。对于首次报道的基因突变通过检索单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms, SNP)数据库(www.ncbi.nlm. nih.gov/SNP) 以排除基因多态性。

1 临床资料和方法

1.1 临床表现

1例有异常出血史明确诊断为GT患者，女性，14岁，先证者双亲为近亲婚配，家系中均无类似出血情况。患者出诊时以皮肤黏膜出血为主要表现，皮肤淤点瘀斑，鼻衄，牙龈出血，月经初潮后以月经过多为主要表现，而无肌肉关节出血。

1.2实验室诊断

1.2.1 筛选试验 血象、血凝指标及全血涂片观察血小板的形态。

1.2.2 确诊实验

1.2.2.1 ADP、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验。采集枸橼酸钠抗凝的全血，离心收集富含血小板血浆（PRP）及贫血小板血浆（PPP）,诱导剂ADP终浓度为2umol/L及瑞斯托霉素终浓度为1.25ug/ml，在血小板聚集仪上检测血小板最大聚集率。

1.2.2.2 流式细胞术检测血小板膜表面糖蛋白αⅡb/β3表达：采集肝素钠抗凝的全血，用CD41-FITC(SZ22)、CD61-FITC(SZ21)和FITC-CD42b（SZ2）单克隆抗体孵育后，流式细胞仪检测血小板表面CD41(αⅡb)、CD61(β3)及CD42b(αIb)表达，用以正常人血小板为对照，根据平均荧光强度计算αⅡb及β3表达量。

1.2.3 其他： 通过检测血浆凝血因子Ⅷ、血浆凝血因子Ⅸ、血管性血友病因子抗原及纤维蛋白原等试验排除出血性疾病。

1.2.4 确诊标准：参照阮长耿、王兆钺《现代血液病诊断治疗学》[4]。

1.3 基因诊断

1.3.1 αⅡbβ3基因分析 根据αⅡb（基因库（NG_008331.））及β3（基因库（NG_008332.））基因序列分别设计扩增αⅡb基因30个外显子和β3基因15个外显子及其侧翼序列的引物。扩增αⅡbβ3外显子应用Oligo 6引物合成软件合成,αⅡb基因分别合成16对引物，β3基因合成15对引物。使用Qiagen公司生产的DNA提取试剂盒提取先证者及其家系成员外周血细胞DNA。扩增体积：25ul，扩增条件为：94℃5 min，然后94℃变性60S，55―65℃退火30S，72℃延伸60s，33个循环后72℃10min延伸。PCR产物送华大测序公司直接测序，发现有突变的PCR产物经反复多次扩增测序验证。

1.3.2确定正常人群中基因多态性及突变 检索SNP数据库及相关文献排除现有的多态性可能。

2 结果

2.1 实验室检查

1例先证者的血凝常规无异常，部分患者检查FVIII:C、FIX:C及WF：Ag均正常（结果未列出），除先证者五血小板计数70×107/L,其他先证者血小板计数正常。ADP诱导的血小板最大聚集率0.9-18.2%（平均为5.62%），瑞斯托霉素诱导的血小板最大聚集率18.1-70.5%（平均为45.5%），先证者四瑞斯托霉素诱导的血小板最大聚集率略低下。流式细胞仪检查结果显示：5例血小板表面膜糖蛋白CD42b(αI b)均正常，先证者1血小板表面膜糖蛋白CD41(αⅡI b)及CD61(β3)表达>50%，先证者2血小板表面膜糖蛋白CD41(αⅡI b)及CD61(β3)表达在10%-50%，其余三个GT家系先证者血小板表面膜糖蛋白CD41(αⅡIb)及CD61(β3)表达

2.2先证者血小板表面膜糖蛋基因诊断

通过PCR扩增结合测序的方法检测了1例先证者的αⅡb与β3基因全部外显子及其侧翼序列，经与基因库中αⅡb的cDNA序列（核酸序列号NG_008331.1）及β3的cDNA序列（核酸序列号NG_008332.1）比对后，我们共发现4例纯合突变、1例双重杂合杂合突变（表2）。为排除所检出的突变为基因多态性，我们检索了SNP数据库及相关文献均未发现这些基因突变。先证者一β3基因中cDNA序列为1199 G>A的纯合突变，导致在400位Cys被Tyr替代。先证者双亲为近亲婚育，我们在先证者双亲中也检测到此位点的突变，其中先证者父亲为此位点G>A的纯合突变，先证者母亲为此位点的G/A杂合突变(图1)。

a: 突变型β3 1199A( 400Tyr ) （先证者及先证者父亲）;

b: 突变型β3 1199G/A（先证者母亲）; c: 野生型β31199G(400Cys)

图1先证者一β3 外显子91199G>A (400Cys>Tyr)纯合突变

3 讨论

整合素αⅡb/β3复合物是钙离子依赖性异二聚体，是血小板膜表面最丰富的膜糖蛋白,在血小板活化后它可以结合纤维蛋白原和血管性血友病因子(von Willebrand factor，vwF)介导血小板的聚集，是正常止血机制的重要成分[5]。αⅡb/β3是纤维蛋白原的受体,获得性或先天性αⅡb/β3的质或量异常可干扰血小板与纤维蛋白原的相互作用从而影响正常止血过程。血小板无力症是先天性αⅡb/β3质和或量的缺陷所导致的一种常染色体隐性遗传的血小板功能障碍性疾病。αⅡb/β3中任何亚基发生异常改变均能导致αⅡb/β3复合物在血小板膜上数量减少和(或)功能缺陷，血小板发生聚集障碍导致GT发生，GT是一种常染色体隐性遗传性疾病，杂合子通常不发病，因此患者中除了αⅡb/β3基因突变的纯合子之外，还有部分是双重杂合突变。除了αⅡb/β3量的减少或缺如(Ⅰ型和 Ⅱ型)外，αⅡb/β3质的异常(变异型)也可以导致纤原受体功能丧失或信息传导障碍[6]。不同的突变形式以及不同的突变位点，其引起GT的机制可能是不同的。GT分3型[7]：Ⅰ型GT占78%，血小板表面αⅡb/β3低于正常值的5%，活化的血小板不能结合纤维蛋白原，血小板“颗粒纤维蛋白原含量明显减少，凝血块缺乏回缩反应。Ⅱ型GT占14%，血小板表面αⅡb/β3为正常的10%～20%，维蛋白原、血小板α颗粒纤维蛋白原含量减少或正常，凝血块回缩异常。Ⅲ型GT又称变异型GT，占8%，血小板表面αⅡb/β3为正常的50％～100％，但活化的血小板不结合或仅结合少量的纤维蛋白原，血小板仅颗粒纤维蛋白原含量减少或正常，凝血块回缩可以从缺乏到正常。目前已报道的GT患者中，绝大多数为I型和Ⅱ型。本研究中，5例GT患者中3例为I型、1例为Ⅱ型、1例为变异型。

先证者一的αⅡb基因中存在1199G>A的纯合突变，导致在400位Cys被Tyr替代，致使400S-S412之间的二硫键断裂，1996年By Christine M等人报道此突变位点，发现血小板内纤维蛋白原减少并不像血小板表面αⅡb/β3减少那样严重，推测此部位半胱氨酸形成的二硫键可能在纤维蛋白原摄取发挥作用[8]。我们在先证者双亲中也检测到此位点的突变，其中先证者父亲为此位点的纯合突变，先证者父亲无明显出血表现，说明不同GT患者临床表现有相当大的异质性，可能与女性生理特征有关，但确切机理还待进一步研究证实。

3 结果

本研究对1个GT家系进行了临床诊断和基因诊断，发现了1种发生于β3基因的突变，为1199G>A(400Cys >Tyr)，此突变为国内首次报道。

参考文献

[1] Nair S, Ghosh K, Kulkarni B,et al. Glanzmann's thrombasthenia: updated [J].Platelets.2002,13(7):387-393.

[2]George JN, Caen JP, Nurden AT. Glanzmann’s thrombasthenia: the spectrum of clinical disease. Blood.1990,75:1383-1395

[3]Bennett,J.S. Structural?biology?of?glycoprotein?IIb-IIIa.?Trends Cardiovasc. Med.1996,6(1):31-37.

[4]阮长耿，吴德沛，李建勇，王兆钺，《现代血液病诊断治疗学》.合肥：安徽科技出版社.2007:223-228.

[5] Ping Chen, Chantal Melchior.Probing Conformational Changes in the I-like Domain and the Cysteine rich Repeat of HumanⅡb/β3 Integrins following Disulfide Bond Disruption by Cysteine Mutations.Journal of Biological Chemistry. 2001,276(19):38628-38635.

[6]阮长耿，血小板的止血功能与出血性疾病. 苏州医学院学报 2001,21(3):241-243.

[7]Boudreaus MK,Lipscomb DL.Clinical,biochemical and molecular aspects of Glanzmann's thrombasthenia in humans and dogs.Vet Path．2001,38(3)：249-260．

[8]Grimaldi CM,Chen F, Scudder LE, Coller BS, French DL. A Cys374Tyr homozygous mutation of platelet glycoprotein IIIa (beta 3) in a Chinese patient with Glanzmann's thrombasthenia.Blood.1996 Sep 1;88(5):1666-1675.