分光光度法测定青果多酚的含量

摘要：以没食子酸为标准品，使用酚试剂，采用分光光度法对青果（Ｆｒｕｃｔｕｓ ｃａｎａｒｉｉ）多酚的含量进行检测。结果表明，酚试剂用量为１．５ ｍＬ，与６ ｍＬ质量分数１０％的Ｎａ２ＣＯ３溶液混合，３０ ℃反应６０ ｍｉｎ，于７６５ ｎｍ处测定吸光度，没食子酸浓度在０．５～２．５ ｍｇ／Ｌ范围内与吸光度有良好的线性关系，回归方程为y＝０．１２１ ２x＋０．００４ 0。该方法能较准确地定量分析青果多酚含量，具有简便、快速、稳定，重现性好的优点。

关键词：分光光度法；酚试剂；青果（Ｆｒｕｃｔｕｓ ｃａｎａｒｉｉ）；多酚

中图分类号：Ｏ６５７．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）06－1242-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Pｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｆｒｏｍ Ｆｒｕｃｔｕｓ ｃａｎａｒｉｉ ｂｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ

ＸＩＡＮＧ Ｌｉａ，ＺＨＯＵ Ｔｉｅ－ｊｕｎｂ，ＷＡＮＧ Ｇｕａｎｇ－ｘｉａ

（ａ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｂ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｌｕｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌｕｚｈｏｕ ６４６０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ in Ｆｒｕｃｔｕｓ cａｎａｒｉｉ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ gａｌｌｉｃ ａｃｉｄ as standard． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ｂｅｓｔ detection ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈａｔ mixing １．５ ｍＬ Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ６ ｍＬ １０％ Ｎａ２ＣＯ３（ｍ／Ｖ）， ａｎｄ ｔｈｅｎ reacting ｆｏｒ ６０ ｍｉｎ ａｔ ３０ ℃ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ７６５ ｎｍ． Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ ０．５～２．５ ｍｇ／Ｌ in which ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗａｓ y＝０．１２１ ２x＋０．００４ 0． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｆａｓｔ， ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ in Ｆｒｕｃｔｕｓ cａｎａｒｉｉ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ； Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ ｒｅａｇｅｎｔ； Ｆｒｕｃｔｕｓ cａｎａｒｉｉ； ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ

青果（Ｆｒｕｃｔｕｓ ｃａｎａｒｉｉ）别名橄榄，为橄榄科植物橄榄的果实，青果具有抗菌［１］、抗病毒［２］、抗肿瘤和抗氧化作用［３－５］，有较高的药用价值。青果化学成分包括挥发性成分、三萜类化合物、香豆精、多酚、蛋白质和氨基酸、脂肪和脂肪酸、矿物质、微量元素等多种成分。其中，多酚为青果中的重要化合物，是其主要功效成分。泸州合江是四川省青果生产基地，具有丰富的种质资源，开发青果的药用价值对继承和发展我国传统医学以及带动和促进当地青果的产业化发展具有重要意义。本研究应用福林－酚比色法对青果多酚进行定量分析，为进一步筛选青果品种，综合开发其药用价值提供参考。

１ 材料与方法

１．１ 材料与仪器

材料：青果（购自泸州宝光医药有限公司，选择优质果实洗净，风干，粉碎）。

分析纯试剂：乙醇、碳酸钠、没食子酸标准品（批号ＭＵＳＴ－１００８０４０１，纯度≥９８％，中国食品药品检定所）；化学纯试剂：酚试剂。

仪器：ＪＹ９６－Ⅱ超声粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ＡＬ１０４／００电子天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；ＳＰ－７５２型紫外－可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；ＤＫ－９８－１恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）。

１．2 方法

准确称取１０ ｍｇ没食子酸标准品，定容于１０ ｍＬ容量瓶中，配制成１ ｍｇ／ｍＬ标准液，取１ ｍＬ标准液定容至１００ ｍＬ，得１０ μｇ／ｍＬ工作液。准确称取青果果实粉２．０ ｇ，溶于４０ ｍＬ的４０％乙醇（体积分数）中，超声４５ ｍｉｎ后，取提取液抽滤，即为样品液，采用分光光度法对青果多酚的含量进行检测［６－８］。

２ 结果与分析

２．１ 测定波长的选择

分别取没食子酸标准溶液和青果样品液在４００～９００ ｎｍ范围内扫描，两者在７６５ ｎｍ处均有最大吸收峰，故选择７６５ ｎｍ为测定波长。

２．２ 试剂用量的确定［９］

酚试剂与１０％的Ｎａ２ＣＯ３（质量分数，下同）溶液比例的确定：取１．５ ｍＬ没食子酸标准溶液，加入１．５ ｍＬ酚试剂，混匀后分别加入０．７５、１．５、３．０、４．５、６．０和７．５ ｍＬ 10% Ｎａ２ＣＯ３溶液，定容至１５ ｍＬ，３０ ℃水浴反应显色后，于７６５ ｎｍ处测定吸光度。结果表明，当10% Ｎａ２ＣＯ３溶液加入量为６ ｍＬ时，体系显色反应较为完全，故确定酚试剂与１０％ Ｎａ２ＣＯ３溶液的体积比为１∶４。

酚试剂用量的确定：取１．５ ｍＬ没食子酸标准溶液，分别加入０．５、１．０、１．５、２．０、３．０和４．０ ｍＬ酚试剂，混匀后加入酚试剂４倍体积的１０％ Ｎａ２ＣＯ３溶液，定容至２１．５ ｍＬ，３０ ℃水浴反应显色后，测定７６５ ｎｍ处吸光度。结果表明，当酚试剂加入量大于１．５ ｍＬ后吸光度达到最大，并趋于稳定，所以确定酚试剂用量为１．５ ｍＬ。

２．３ 稳定性检测［１０］

酚比色法的稳定性结果见表１。由表１可知，在反应前期吸光度随时间增加而上升，１２０ ｍｉｎ内吸光度变化较为平缓，表明反应完全，在此阶段稳定性好，从提高效率的角度考虑选择反应时间为６０ ｍｉｎ。

２．４ 精密度试验

取３份青果样品液各１．５ ｍＬ，按照上述方法加样，反复测定５次，结果见表２。结果表明该方法具有较高的精密度，能满足样品分析的要求。

２．５ 标准曲线的制作

取５支１０ ｍＬ具塞试管，分别加入０、０．５、１．０、１．５、２．０和２．５ ｍＬ １０ μｇ／ｍＬ的标准溶液，１．５ ｍＬ酚试剂和６ ｍＬ １０％ Ｎａ２ＣＯ３溶液，30 ℃水溶60 min后测定OD765 nm。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y＝０．１２１ ２x＋０．００４，Ｒ２＝０．９９８ ６（图１），表明没食子酸浓度在０．５～２．５ ｍｇ／Ｌ范围内与OD765 nm呈现良好的线性关系，方程可用于青果多酚的定量测定。

２．６ 重现性试验

检测６份同一青果样品液中多酚的含量，结果见表３。结果表明在该条件下青果多酚的平均含量为３．３０９％，ＲＳＤ＝２．８２１％，重现性符合要求。

２．７ 回收试验［１１］

将已知含量的青果样品液６份，０．４ ｍＬ／份，分３组，各精确加入没食子酸４，８和１２ μｇ，按照上述方法测吸光度，取平均吸光度计算多酚含量。按照下列公式计算回收率：

回收率＝（总多酚含量－原样液多酚含量）／加标量×１００％

其回收率在９６．２７５～１０３．６００％之间，平均回收率为１００．２０１％，ＲＳＤ为３．１２１％（表４）。结果表明该方法准确可靠，可用于青果多酚的定量分析。

３ 小结

目前多酚含量的测定方法主要有高锰酸钾法、比色法、色谱法等。其中高锰酸钾法简便易行，但被测液中的还原性物质一般均能被氧化，选择性不高；色谱法测定速度快、灵敏度高，但需要进行繁杂的衍生前处理，且分析成本高。相比较而言，分光光度比色法测定总多酚含量简便、快速［１１］。青果为药食兼用型水果，多酚是青果的重要药效成分，主要集中在果肉中，与青果的苦涩味和药理作用密切相关［７］。本试验采用福林－酚比色法测定青果中的多酚含量，其最佳条件为：酚试剂１．５ ｍＬ、１０％ Ｎａ2ＣＯ３ ６ ｍＬ、在３０ ℃下反应６０ ｍｉｎ，测定波长为７６５ ｎｍ。该方法操作简便、稳定、重现性好、结果准确可靠。

参考文献：

［１］ 王 瑶，惠 曦，田 吉． 橄榄多酚对口腔致病菌的体外抑菌实验研究［Ｊ］． 泸州医学院学报，２００８，３1（６）：６１３－６１６．

［２］ 杨 洁，孙 魏，杨旭锐，等． 青果抗人免疫缺陷病毒活性部位的筛选研究［Ｊ］． 中国药房，２００８，１９（２１）：１６０３－１６０５．

［３］ ＥＭＩＬＩＡ Ｊ Ｍ， ＷＥＮＺＥＬ Ｕ， ＲＵＩＺ－ＧＵＴＩＥＲＲＥＺ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｏｌｉｖｅ fｒｕｉｔ eｘｔｒａｃｔｓ iｎｈｉｂｉｔ pｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ iｎｄｕｃｅ aｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨＴ－２９ hｕｍａｎ cｏｌｏｎ cａｎｃｅｒ cｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２００６，１３６（１０）：２５５３－２５５７．

［４］ ＳＡＬＴＡ Ｆ Ｎ， ＭＹＬＯＮＡ Ａ， ＣＨＩＯＵ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ sｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ eｄｉｂｌｅ vｅｇｅｔａｂｌｅ oｉｌｓ eｎｒｉｃｈｅｄ ｉｎ pｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｗｉｔｈ oｌｉｖｅ lｅａｆ eｘｔｒａｃｔ ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ２００７，１３（６）：４１３－４２１．

［５］ ＭＡＮＮＡ Ｃ， ＧＡＬＬＥＴＴＩ Ｐ， ＣＵＣＣＩＯＬＬＡ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ pｒｏｔｅｃｔｉｖｅ eｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ oｌｉｖｅ oｉｌ pｏｌｙｐｈｅｎｏｌ（３，４－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－ｅｔｈａｎｏｌ cｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ rｅａｃｔｉｖｅ oｘｙｇｅｎ mｅｔａｂｏｌｉｔｅ－iｎｄｕｃｅｄ cｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｃａｃｏ－２ Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， １９９７，１２７（２）：２８６－２９２．

［６］ 潘文洁，李敬华，王建通． 大山村野茶茶多酚提取工艺研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２０１０，３８（２４）：１３０１２－１３０１３，１３０１５．

［７］ 何志勇，夏文水． 橄榄果实中酚类化合物的分析研究［Ｊ］． 安徽农业科学，２００８，３６（２６）：１１４０６－１１４０７．

［８］ 周志娥，熊建华，闵嗣，等． 南瓜花黄酮超声波辅助提取工艺的研究［Ｊ］． 湖北农业科学，２０１１，５０（５）：１０２３－１０２５．

［９］ 何志勇，夏文水． Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ比色法测定橄榄中多酚含量的研究［Ｊ］． 林产化学与工业，２００６，２６（４）：１５－１８．

［１０］ 张国友，唐 玲，陈 玮，等． 分光光度法测定蒙古栎叶中多酚的含量［Ｊ］． 中国科学院研究生院学报，２００９，２６（３）：３１９－３２２．

［１１］ 罗杨合． Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法测定马蹄皮中多酚的含量［Ｊ］． 湖北农业科学，２００９，４８（９）：２２４７－２２４９．