血小板抗原基因分型及临床配型应用研究

【摘要】目的：对患者进行血小板抗原基因分型与配型的研究，以探讨临床血小板输注的安全性和疗效。方法：应用聚合酶链序列特异性引物技术(PCR-SSP)，对长沙地区44例患者（人血小板抗原）HPA1～5、15系统等位基因进行分型。结果：血小板基因配型吻合组血小板输注后CCI 1、CCI 24效果明显优于配型不合的对照组。结论：对患者进行血小板抗原基因分型与配型可提高血小板输注的安全性和疗效。

【关键词】人血小板抗原；基因分型；配型；血小板输注

文章编号：1009-5519（2007）09-1265-02 中图分类号：R446 文献标识码：A

血小板同种抗原包括存在于血小板上的与其它细胞和组织共有的抗原,有ABO血型抗原、HLA-Ⅰ类抗原，以及血小板特异性抗原（human platelet alloantigen，HPA）[1]。特异性抗原是由血小板特有的抗原决定簇组成，表现血小板独特的遗传多态性,相应基因遗传多态性的分子基础也被阐明,目前已有22个HPA被正式命名。而血小板抗原抗体的同种免疫是影响血小板输注效果的重要因素之一,在新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、血小板输注无效等疾病中具有重要意义。随着HPA基因深入研究及基因检测技术的不断成熟，国内外血小板基因分型和临床应用研究逐步得以开展实施[2]。本文对100例长沙机采健康献血者和长沙44例输注血小板的患者HPA 1～5、15系统基因进行了分型，结合临床反馈资料，观察基因配型输注效果，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 检测标本：DNA样本来源于100例长沙机采健康献血者以及44例输注血小板的患者血样。患者标本来自湘雅三医院，血样以EDTA抗凝,采用盐析法制备基因组DNA,-20 ℃保存备用。

1.2 仪器与试剂：9600型PCR扩增仪（美国PE公司）,HPA 1～5、15系统基因分型试剂盒（美国G&T公司）, Taq酶（Promaga公司），凝胶图像分析系统（美国UVP公司）。

1.3 血样DNA提取：快速盐析法（Pel-freez公司），操作按说明书进行。

1.4 PCR反应体系：HPA 1～5、15的PCR反应体系共12个，其中引物Mix(含引物，DNTP，Mg2+，缓冲液)各7 μl,样本DNA 1 μl（含0.05～0.10 μg DNA）及含0.33～0.5U Taq酶1 μl,每个总反应体系为9 μl。

1.5 PCR循环参数：首先以95 ℃变性5分钟，然后按95 ℃ 30秒、60 ℃ 30秒、72 ℃ 90秒共30个循环，72 ℃延伸5分钟。

1.6 扩增产物鉴定：配制2%琼脂糖凝胶，取5 μl PCR产物直接点样到凝胶孔中，使用0.5×TBE缓冲液以10 V/cm电泳20分钟。凝胶图像分析系统紫外光下拍照记录,观察结果。

1.7 患者与供者HPA基因相合组与不相合组血小板输注的比较：将输注血小板的患者分为基因吻合者（吻合组）及配型不合者（对照组）两组，分别输注前、输注后1小时和24小时进行血小板计数，同时记录输入的血小板总量及患者的体表面积，计算输注后1小时和24小时患者纠正的计数增值（CCI），比较两组的有效率。

2 结果

2.1 100例机采健康献血者进行HPA基因分型,其ABO血型、HPA基因型分布情况：见表1。

2．2 44例输血小板的患者进行HPA基因分型，其ABO血型、HPA基因型分布情况，见表2。

2．3 44例输血小板的患者进行血小板基因分型，共收到临床反馈资料44份，其中基因型吻合者(吻合组)21份，配型不合者(对照组)23份。吻合组与对照组血小板输注后1小时、24小时平均CCI值见表3。对吻合组及对照组血小板输注后1小时、24小时的输注有效率进行比较：见表4。

3 讨论

HPA的研究在临床和输血实践中有着十分重要的意义。血小板上有HPA，并具高度多态性，它的多态性是由位于血小板上的糖蛋白的单个碱基取代而导致相应氨基酸的改变而形成。血小板抗原不合，可导致血小板输注无效、输血后紫癜以及新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜等[3]。 近年来，国外对血小板抗原基因分型进行了很多研究，我国的研究则多集中于HPA 1～5系统，临床上大部分地区没有对血小板抗原基因分型及配型。导致临床血小板输注效果不理想，并且增加了患者的负担。进一步研究和认识HPA，提高临床血小板输注的安全有效性，是一个十分有意义的课题。

本文采用PCR-SSP法对长沙地区100名健康献血者HPA 1～5、15系统等位基因进行分型，建立了长沙地区血小板基因频率数据库和已知HPA基因型献血者资料库，以满足临床对血型相合血小板的需求，避免血小板同种抗体的产生，保证血小板输注的安全性和有效性。本研究数据提示，HPA-1a、2a、4a、5a存在于每一个样本中，而HPA-1b、2b、5b则极少见，HPA-4呈单态性分布，HPA-3、15系统最具多态性并存在aa、ab、bb三种表型，而HPA抗体的产生与相应HPA抗原在群体中的分布频率密切相关[4，5]。

对本区44例患者进行了HPA基因分型和配型，从反馈的44例临床结果来看，基因吻合组患者血小板输注后1小时、24小时的平均CCI值比对照组显著升高，从两组输注的有效率来看，吻合组输注后1小时、24小时有效率均为100％，而对照组则为91.3％和87.0％，明显不及吻合组，说明血小板经配型后输注效果明显优于对照组。目前，国内血小板相关抗原、抗体检测技术的局限性及普及面小，临床上血小板输注时只考虑ABO血型相同，而忽视了HPA相配合的问题。建议为临床上需反复、多次输注血小板的患者提供HPA相配合的血小板，以提高临床血小板输注的安全性和有效性[6]。

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