atp1基因在小麦BNS雄性不育系和自身转换系中的差异表达

摘 要：atp1基因在植物中是线粒体基因组编码，其产物ATPl是线粒体ATP合酶F1的α亚基，在小麦BNS的雄性不育系和它的转换系中差异表达。为了检测该基因的表达丰度，探讨与BNS不育性的联系，以BNS不育系和它的转换系的幼穗、花药和穗轴等组织为材料，利用实时荧光定量PCR方法，测定和比较该基因在不同组织中的表达水平，结果表明，该基因在各组织中的总表达量比内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因表达量高3―4个数量级；在幼穗及各穗轴营养组织中表达量一致；花药与营养组织比较，在不育系四分体和单核期花药中表达均上调：在不育系中，该基因表达量在单核期花药中显著下调。 这些结果说明.线粒体atp1基因在小麦中是一个高水平表达基因.在BNS营养组织中组成型表达，在花药异性上调表达，在不育系中表达受到抑制，表现显著下调.表明atpl基因的下调表达与BNS不育性有关。

关键词：小麦：BNS雄性不育；atp1；基因差异表达分析；荧光实时定量PCR

图分类号：Q785

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）06-0488-06

ATP合酶（ATP synthase）是高等植物细胞内最人的酶系之一，定位在细胞质基质、叶绿体、线粒体等细胞器的内膜上。ATP合酶由两部分组成，即F0和F1，当F0和F1在结合状态时表现ATP合成酶的活性，在分离状态下是ATP水解酶活性。线粒体ATP合酶的FI有9个亚基，Fo的亚基数不同物种数量不同。线粒体F1中的α亚基有3个分子，与β亚基3个分子交替排列，旋转时合成ATP。研究已经明确，线粒体F1α亚基基因atp1位于线粒体基因组上，产物是α亚基蛋白ATPl，其表达是组成型的，但也受核基因调控。

植物雄性不育是植物的雌蕊发育止常，雄蕊发育不正常，不产生有功能花粉的一种现象。具有该特性的不育系是作物杂种优势利用的核心材料。对不育机制进行研究，多数结果都显示，不育系中与能量供应的相关代谢途径和组成成分出现异常，表现ATP/ADP比率减少、ATP合酶活性降低、不育和可育植株之间ATPI差异表达、以及atpl基因差异表达等。

BNS （Bai-nong slerility，BNS）是一种新发现的对温度敏感的小麦雄性不育系，有良好的不育性和转换性，在杂交小麦利用中有重要价值。在前期的BNS蛋白质组学研究中，发现该不育系和转换后的可育系的四分体到二核期花药中，线粒体ATP合酶α亚基蛋白ATP1差异表达，在不育系中表达下调，并认为ATP1的数量下调，将导致ATP合酶组装量减少，结果会使ATP合酶总体活性下降、ATP产量降低，能量供应不足。细胞内基因表达水平和它的产物蛋白质的表达水平并不都是一致的，但atp1基因在BNS的花药和组纵中的表达水平尚未被检测。为了进一步探时该基因在BNS中的表达特性，本文以BNS的花药以及幼穗和穗轴等组织为材料，利用实时荧光定量PCR （Real time quafititative PCR，qRT-PCR）方法，检测和比较该基因在不育系以及它的转换后的可育系小孢子形成前后，也是BNS败育的关键时期，在这些组织中的表达水平，揭示atpl基凶对BNS雄性不育发生的影响和作用。

1 材料与方法

1.1 BNS的种植和取材

BNS是本实验室培育并套袋自交保存的材料，在河南辉县小麦实验基地种植，自 10 月 1日到11月18口，每8d播种l期，共播7期。 1）不育系取材：参考苏晴等的方法，在不育播期（10月1日和10月9 日）的材料进入雌雄蕊分化期后取幼穗材料；到四分体期和单核期后，每天上午7时左右从田间取穗，实验室显微镜检查花粉发育时期正确，在15 ℃以下室温环境，冰块上剥取中上部小穗第一和第二小花的6枚花药，并及时收取；同时取无小穗的穗轴为营养组织材料；2）转换系和转换后的可育系取材：10 月 l7 日播种的材料花粉发育开始转换，可育花粉比例逐渐上升。转换系取10 月 25 日播种的材料，可育系取11月18日播种的材料，取材的小孢子发育时期与不育系相同；3）F1的取材：F1组合为BNA×中国春，10月8日播种，是BNS的不育期，中国春可恢复BNS的育性，因此F1是可育的。

取下的幼穗、花药、穗轴即时在液氮中冷冻1～2 min，取出放入-80℃冰箱巾保存。共取l0个样品，10个样品的编号为wh-l～wh-10，对应的发育时期分别为：不育系药隔期幼穗、不育系叫分体花药、不育系四分体穗轴、不育系单核期化药、F1四分体期花药、F1四分体期穗轴、转换系单核期花药、转换系单核期穗轴、可育系单核期花约和可育系单核期穗轴。

1.2 qRT-PCR方法

1.2.1 引物

用苏晴在BNS花药中检测设汁的引物，序列为：primer F 3'-TTCCGCGATAATGGAATG-CACGCA-5'；Drirner R 3'-_AGCTACCTGCACCT-GTCTGGTCCC -5'，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2.2 主要试剂与仪器

实验所用试剂主要有RNA提取试剂盒（In-vitrogen，USA）、Promega公司（北京）的AMV逆转录酶系统、中国大连定显PCR酶TaKaRa TaqTMHot Start Version（日本Takara公司）、Roche公司（瑞士）的Green I Master。实验所用主要仪器有：罗氏480荧光实时定量PCR仪、2720 thermal cycler（ABI，USA） PCR扩增仪、和Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer （Nan（Jdrop technologies， USA）检测仪等。

1.2.3 总RNA提取

材料总RNA提取采用Trizol方法，见苏睛，50 mg样品液氮研磨至粉末，1 mL Trizol总RNA抽提液提取.预冷的75%乙醇洗涤RNA，真空冷冻干燥。干燥的RNA提取物溶于20～40 μL DEPC水，取1.5μL紫外分光光度计检测其浓度和A260/A280的比值：根据浓度取0.5μg RNA用1%琼脂糖做纯度检测，条件是：0.5xTBE，4 V/cm，45 min。

1.2.4 cDNA第一链合成

根据Promega公司的操作说明书，1μL OligodT （0.5 μg/μL）和2.0 μg Total RNA加入PCR管，补充DFPC-H20至9μL。混匀后离心，70℃温浴10 min，在0 ℃冰浴中与模板退火。之后，用5xRT buffer 4μL、10 mmol/L dNTPs 2μL、RNasin0.5 μL、AMV-Rtase lμL、DEPC H20 3.5 μL，混匀后42 ℃水浴2min，再加入M-MLV逆转录酶2 μL， 42℃孵育l h完成RT，70 ℃处理10 min使RT酶失活，得到的RT反应产物cDNA，可立即用于PCR，或保存在-80 ℃下备用。

1.2.5 目标基因荧光定量

使用荧光标记PCR方法，荧光染料为SYBRCreen I，罗氏480荧光实时定量PCR仪，3次重复，采用20 μL反应体系：模板1μL，上下游引物各0.5μL， Q-PCR Enhancer 5μL，2xSYBRSYBR Green I 10 μL， DEPC-H20 3μL。PCR反应程序采用二步法：95℃预变性5 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，45个循环，每次在延伸阶段读取吸光值；在PCR反应完成后做熔解曲线分析，方法是在95℃变性l min，冷却至65 ℃，然后从65℃到95℃，每秒增加0.1℃，同时读取吸光值。

1.2.6 计算方法

qRT-PCR结果的比较有不同层次，本实验数据处理参考Jiang等的计算方法，在Ct和AACt水平比较，Ct≥l，相对丰度的倍数2-Ct≥2，即达差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 样品RNA质量检测

Trizol方法提取的花药总RNA，50 mg样品提取后定溶到30 μL体积，电泳检测结果见图l：OD260/OD20比值检测结果，穗轴组织为1.79～1.84，花药组织为1.83―1.94。两项检测结果均显示RNA质量符合要求。

2.2 实时定量扩增结果

荧光染料标记的PCR方法，预试的扩增曲线和溶解曲线见图2，显示扩增的3个阶段典型，扩增产物单一。内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH， glyceraldehyde -3 -phosphate dehydroge-nase）基因，获得的样品ACt、内参Ct见表l，各样品间Ct见表2，部分样品间AACt的比较见图3。

2.3 不同组织间的表达量比较

从表1、2和图2可看出，atp1基因是一个高表达水平基因，相对表达量比内参基因甘油醛一3-磷酸脱氢酶高4个以上Ct数量级，在BNS的10个组织中的表达模式有如下特点：1）该基因在不育系、可育系和F1的4个穗轴组织中，即，不育系四分体穗轴、F1四分体期穗轴、转换系单核期穗轴和可育系单核期穗轴，它们的Ct值相近，分别是-6.613、-6.147、-6.973和-6.177，相互之间的Ct值均小于l（见表2），说明该基因在营养组织中组成型表达；2）该基因在4组花药组织和穗轴组织中的表达，均显示花药中表达水平高于穗轴组织，见图3A，其中3组（wh-5/wh-6、wh-7/wh -8、wh -9/wh -10） Ct值大于l，分别为一1.593、-1.831、-2.047，差异达显著水平，wh -2/wh一3为-0.923，接近1，表说明atp1基因在花药异性上调表达；3）该基因在4个花药组织之间的表达水平比较，显示不育四分体期花药中与药隔期穗组织中表达一致，仍在较高水平，但到单核期，不育系花药中表达下调，而在转换系和可育系的花药中，基因表达保持较高水平（图3B），单核期的下调数量，与不育系四分体期、转换系单核期和可育系单核期的表达量之间的Ct值绝对值均大于l，达显著水平（见表2），表明该基因在不育系单核期的下调表达与BNS的不育性相关：4）样品Wh-l是不育期BNS减数分裂前的幼穗组织，该样品的基因表达量与5个花药样品表达量结果比较，4个不显著，但与4个穗轴的ACt比较.3个显著.说明药隔期幼穗的基因表达特性与花药接近。幼穗组织虽属营养组织，但它是穗营养组织、花药营养组织、孢母细胞生殖组织等的混合体，已经观察到BNS在该时期对温度敏感，说明atp1基因在雌雄蕊分化时期时已开始差异表达。

从这些结果可以看出，atp1基因在BNS不育系、转换后的可育系，以及与中国春杂交的F1的穗各组织中总体上是组成型表达；在不育播期条件下，分化的幼穗组织，包括四分体期的花药，表达量处在较高水平，但到单核期表达量显著下调；在转换播期和可育播期的条件下，这些组织的该基因表达量保持在较高水平。

3 讨论

植物雄性不育体系是杂种优势利用的关键技术.探讨其不育机制，对认识不育的特征特性和创造多遗传背景不育类型等有重要指导作用。对水稻、烟草、油菜等作物雄性不育的研究，曾发现花药能量供应短缺，ATP合酶α亚基蛋白及它的基因差异表达，因此认为atpl是一个重要雄性不育相关基因，本文检测到该基因在BNS不育系小孢子单核期表达量显著下调，说明该基因的表达与小麦的雄性不育性存在联系。

3.1 atpl在BNS可育系穗组织中组成型表达，花药中上调表达，不育系花药中显著下调

atp1基因在植物雄性不育中的表达模式，过去的研究有不同结果。Bergman在烟草中检测atpl基因位于雄性不育基因orf274下游，并共转录，对ATP的合成影响显著，但基因和蛋白质表达水平没有检测出差异；黄思齐在红麻中检测到atp1基因序列在不育系和保持系中完全相同，但在不育系的叶片和花药中表达量下降；Wenliang等检测了油菜细胞质雄性不育中10个线粒体基因表达谱.除atp6差异表达外，其他9个，包括atpl，表达差异不显著，宋国琦等在小麦YS雄性不育A3017中利用cDNA-AFLP方法分离出atpl基因。可以看出，这些研究结果中，一些显示atp1基因的表达是组成型的，一些结果是差异表达的。本实验结果显示atp1基因在小麦BNS各营养组织中表达量一致，符合组成型表达的基本模式，但在可育花药中表达量比在穗轴等组织中表达显著上调，说明该基因表达在花药中具有上调表达特异性。在不育系单核期榆测到表达量显著下调，说明BNS的不育性与atp1基因的缺陷表达存在联系，这种缺陷表达，基因表达下调模式与蛋白质组学检测的蛋白质下调表达模式结果一致。

3.2

atpl是BNS的重要不育相关基因

BNS是一个对温度敏感的雄性不育系，当花药发育过程中气温升高，花粉育性可白行恢复，这说明BNS花粉发育的一些重要功能基囚，包括atp1基因，其基因本质没有改变，改变的是在不同的发育条件下，一些基因功能发生改变，发育条件恢复，基因功能恢复。因此atpl基因不是不育基因，而应是不育基因调控下的一个重要相关基因。推测该基因，或该基因的产物，是上游不育基因及产物的重要受体，以一种尚未知的方式影响着花粉的发育。虽然这个影响过程未知，但其结果是易被理解的，ATP在生物体中的重要地位，足以影响到花粉代谢的全部过程。因此，atp1的差异表达，以及前期研究的ATP1蛋白的缺陷表达，可直接导致ATP合成酶的组装，ATP合成酶数量减少，将直接导致能量生成减少和供应短缺，导致花粉发育败育。

3.3 atp1基因在单核期表达下调有发育生物学依据

检测结果中发现atpl基因在不育四分体期花药中表达量仍较高，到单核期花药表达下调，该结果有花粉发育进程原因。atp1基因是线粒体基因组编码，线粒体基因组基因表达受线粒体本身和核基因共同调控。小孢子是一个配子体世代，花粉内核基因和质基因表达是一个相对独立的过程，这个过程应从小孢子游离后，即单核期开始。因此，四分体后，小孢子开始独立发育，花粉发育基因表达程序性启动。不育核基因对质基因的调控一般是抑制性的，因此atp1基因表达受到核不育基因抑制而下调。该结果对进一步探讨不育基因对靶基因作用有重要意义。