缺血预处理联合后处理对兔肝缺血再灌注损伤的保护作用

【摘 要】目的：评价缺血预处理联合后处理对兔肝缺血再灌注损伤的保护作用。方法：取健康日本大耳白兔30只，体重1.5～2.0 kg，雌雄不拘，随机分为5组（N=6）：假手术组（S组）、缺血再灌注组（IR组）、缺血预处理组（IP组）、缺血后处理组（IPo组）和缺血预处理联合后处理组（IP+IPo组）。S组仅开腹，游离肝脏，分离肝门但不阻断；IR组采用阻断肝门45 min再灌注6 h的方法制备肝缺血再灌注模型；IP组阻断肝门10 min，再灌注10 min，反复3次，余操作同IR组；IPo组阻断肝门45 min后，灌注1 min，再缺血1 min，反复3个短暂的循环，再灌注6 h，IP+IPo组在IP组的基础上再行3个灌注1 min，再缺血1min的循环，后再灌注6 h。于再灌注6 h时，经颈动脉抽血后迅速处死兔取肝，测定血清谷丙转氨酶（ALT）及天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，然后取肝组织，分离肝细胞，测定线粒体膜电位及线粒体Na+-K+-ATP酶活性。 结果：与S组比较，其余各组血清ALT和AST活性升高，线粒体Na+-K+-ATP酶活性及线粒体膜电位降低（P

【关键词】缺血预处理；缺血后处理；肝；线粒体；再灌注损伤

【中图分类号】R363 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）04-0576-02

肝脏缺血―再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是临床常见的病理生理现象，也是许多肝缺血疾病预后不良的重要原因。因此，深入研究I/R肝损伤的病理生理机制及寻找各种抗I/R肝损伤策略一直是肝脏研究领域的重要方向。当今，缺血预处理及缺血后处理单独应用对I/R肝的保护作用已得到普遍的认可，但关于二者联合应用的效果研究较少。本研究拟通过建立兔肝缺血再灌注损伤模型，评价肝缺血预处理联合后处理对兔肝脏保护作用的效果，为预防与减轻肝缺血再灌注损伤提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

健康日本大耳白兔30只，体重1.5～2.0kg，雌雄不拘，由滨州医学院实验动物中心提供。

1.2 实验分组及模型制备

随机分为5组（N=6）：假手术组（S组）、缺血再灌注组（IR组）、缺血预处理组（IP组）、缺血后处理组（IPo组）和缺血预处理联合后处理组（IP+IPo组）。实验前禁食12h，自由饮水。氨基甲酸乙酯1.0g/kg静脉麻醉，分离左侧颈外静脉及右侧颈内动脉以备给药及采血。消毒开腹，暴露肝门，于尾状叶上方游离肝左叶、中叶、右中叶及方形叶的血管、胆管，用无损伤钳夹闭血管，造成该四叶完全性缺血，45min后松夹重新灌注45min形成HIRI模型[1]。

1.3 统计学处理

3 讨论

复杂的肝切除、肝移植等临床手术过程中，常见到肝脏缺血再灌注损伤，目前尚未完全澄清肝脏缺血再灌注损伤机理，在预防上也无有效抑制的措施[3]。2003年研究发现，在心肌缺血结束后再灌注之前若先给予多次短暂灌注、再缺血的处理，具有与缺血预处理相似的心脏保护作用[4]。也有发现研究表明，心肌缺血预处理联合后处理的心肌保护作用较单独应用时效果好[5，6]。本实验以此为基础，进行了对兔肝脏缺血再灌注及缺血预处理、后处理、联合处理的观察。

丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST），是肝细胞损害的敏感的指标，也是目前应用最广、最有实用价值的实验室检测肝功能指标之一。丙氨酸氨基转移酶被誉为是肝细胞损害的“金标准”，主要存在于肝细胞浆中，其肝内含量约是血中的100倍。谷丙转氨酶在肝脏的活性是循环内总活性的100000倍，故血清谷丙转氨酶活性变化可以反映肝细胞损害程度[7]。天门冬氨酸氨基转移酶（AST），又称谷草转氨酶，是人类机体内一种十分重要的酶，是反映肝细胞坏死的标准。可以和ALT结合起来反映肝功能的状况。

缺血再灌注过程中线粒体损伤的机制涉及多个环节。肝脏缺血时，线粒体周围细胞内微环境的剧烈改变，以及供氧的停止导致了ATP的耗竭和离子失调[8]。本实验中，与S组比较，其余各组血清ALT和AST活性升高，线粒体膜电位及线粒体Na+-K+-ATP酶活性降低，表明肝缺血再灌注损伤模型制备成功。肝细胞缺血时，缺氧导致细胞内乳酸堆积，增加了Na+-H+、Na+-Ca2+交换，同时大量Ca2+内流；而再灌注期间自由基可介导细胞膜脂质过氧化损伤，细胞内Ca2+的堆积，从而磷脂酶被激活，增加了线粒体膜通透性，导致线粒体钙超载。后者可干扰线粒体氧化磷酸化，致肝细胞能量代谢障碍；同时可促进细胞膜结构中的磷脂水解，使线粒体膜电位降低、Na+-K+-ATP酶活性下降，最终导致线粒体功能障碍[9]。而线粒体在再灌注中受到了氧化应激损伤，线粒体不可逆损伤是缺血细胞死亡的原因。Peralta等发现在持续肝脏缺血过程中，缺血预处理可降低ATP降解，诱导代谢的停止以及相关代谢下调，对缺血再灌注的肝脏提供保护作用。缺血后处理通过缓慢复流减少ATP合成的前身物质的丢失，增多ATP生成，缺血组织氧供缓慢恢复，中性粒细胞呼吸爆发减少，同时减少活性氧（ROS）的生成；同时可激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号转导（PI3K/Akt）通路，线粒体得到更好的保护。与IR组比较，IP组、IPo组和IP+IPo组血清ALT和AST活性降低，线粒体Na+-K+-ATP酶活性及线粒体膜电位升高，表明缺血预处理、后处理及预处理联合后处理，都能改善肝脏的再灌注损伤；与IP组和IPo组比较，IP+IPo组血清ALT和AST活性降低，线粒体Na+-K+-ATP酶活性及线粒体膜电位升高，这表明预处理联合后处理对于减轻肝脏缺血再灌注损伤的效果优于单独应用，该组的保护作用最强。

综上所述，IP和IPo联合应用能更好的保护线粒体，维持组织的能量代谢稳定，从而在再灌注早期更好的减轻肝脏的损伤。本研究为在临床上对肝脏I-R损伤预处理提供了实验基础。

参考文献：

[1] 王万铁，徐正，林丽娜，等.家兔肝缺血再灌注损伤时氧自由基的动态变化[J].温州医学院学报，1998，28（4）：301-302.

[2] 袁贵秀，常业恬，李李等.缺血后处理对兔肝脏热缺血再灌注损伤的保护[J].中国现代手术学杂志，2007，1（12）：98-100.

[3] 汤礼军，崔建峰，罗浩等. 肝脏缺血再灌注肝细胞凋亡与肝细胞糖原关系的实验研究[J].西南国防医药，2010，20（6）：584-586.

[4] 沈广海，高爽，沈兆亮等.缺血后处理通过线粒体途径减轻缺血再灌注诱导的肝细胞凋亡[J].中国医药导报，2011，8（12）：21-23.

[5] Yang XM，Proctor JB，Cui L，et al.Multiple，brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways.J Am Coll Cardiol.2004，44：1103-1110.

[6] Sato H，Bolli R，Rokosh GD，et a1.The cardioprotection of the late phase of ischemic preconditioning is enhanced by postconditioning via a COX-2-mediated mechanism in conscious rats.Am J Physiol Heart Cire Physiol.2007，293：H2557-H2564.

[7] PRATTD S，KAPLAN MM.Evaluation of abnormal liver-enzyme results in asymptomatic paitents[J].N Engl J Med，2000，342：1266-1271.

[8] Saris NE，Eriksonnon KO.Mitochondrial dysfunciton in iseheima- reperfusion[J]. Acta Anaestesiol Scand，1995，39：171-176.

[9] 甄允芳，孙庆林，汪健，等.褪黑素对大鼠肝缺血再灌注后线粒体损伤的保护作用.中华小儿外科杂志，2006，27：668-669.