NaCl胁迫对转IrrE基因烟草抗氧化酶活性的影响

摘要:文章主要研究了转IrrE基因烟草幼苗对NaCl胁迫的耐受性应答情况。结果表明,在200mmol/L NaCl胁迫下,其中野生型烟草随着胁迫时间的延长,POD、SOD、CAT三种抗氧化酶活性和可溶性蛋白的含量逐渐升高,处理24 h后达到一个峰值,然后又逐渐降低,叶片的相对含水量一直逐渐降低,而转IrrE基因烟草幼苗三种抗氧化酶活性和可溶性蛋白持续上升,相对含水量先有所降低然后逐渐升高,5个生理指标均高于野生型烟草。因此,IrrE基因作为一种转录因子可能调控了盐胁迫相关基因的表达,从而提高了植物对NaCl胁迫的耐受能力。

关键词:IrrE基因;抗氧化酶;烟草

中图分类号:S572 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)06-0063-2

土壤盐渍化问题可谓触目惊心,正肆无忌惮地吞噬着人类赖以生存的有限的土地资源,成为严重制约农业生产的一个全球性问题。植物耐盐的分子生物学和植物耐盐基因工程在提高农作物耐盐能力方面正起着越来越重要的作用。相关的研究表明,由高浓度的NaCl等盐分引起的植物氧化胁迫是非生物胁迫中一个非常重要的潜在因素。对于微生物和高等植物而言,代谢产物则是应对氧化胁迫的重要组成部分。在高盐胁迫条件下,植物体内SOD等酶的活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关,而且在盐分胁迫下,盐生植物与非盐生植物相比,其SOD、CAT、POD活性更高,因而更能有效地清除活性氧,防止膜脂过氧化。可溶性蛋白质可以缚更多的水,而水含量的增加也能避免或减少因细胞脱水引起的蛋白质变性[5],从而二者含量的提高均能有效提高植物对盐胁迫的耐受性。

烟草(Nicotiana tabacum)属于茄科烟草属植物,是我国重要的经济作物之一,种植面积很大,其产量最近几年均居世界首位。本实验选取转IrrE基因烟草作为研究对象,与野生型烟草进行比较,考察在200mmol/L NaCl胁迫下转IrrE基因烟草幼苗叶片中POD、SOD和CAT三种抗氧化酶活性、以及可溶性蛋白质含量和相对含水量的变化,为探明IrrE基因对NaCl胁迫的耐受性应答提供初步的生理生化证据。

1 材料与方法

1.1 植物材料,实验材料

F1代转IrrE烟草种子(K326)由本实验室保存。

1.2 酶、试剂、引物

Taq酶、Buffer购买于天根生物技术有限公司;PCR引物由英俊生物技术有限公司合成,序列如下:F 5’-3’ CAACGTCATCCTCATCAACTC和R:5’-3’ TCCACCTCCGCCTTCATTT。

1.3 转基因烟草种子的培养

选取籽粒饱满的烟草种子,4℃过夜春化,然后取出70%乙醇浸泡30s,2%的NaCl溶液浸泡8-10min,无菌水冲洗5-6次。黑暗中吸胀12h,将其置于蛭石和营养土(1:1)中培养(25±1)℃,光照12h,每天补充水2次。待幼苗长至3-4片叶后,选取大小一致的烟草幼苗,用200mmol/L NaCl的对烟草苗进行盐处理,分别在处理后0h、12h、24h、36h和48h时取样,重复3次,取其平均值。

1.4 植物总DNA提取

采用CTAB法提取烟草DNA,存于-20℃备用。

1.5 烟草转基因苗的PCR分析

取制备好的烟草总DNA,按以下反应程序进行扩增:94℃、3min;94℃、1min,55℃、1min,72℃、1min,30个循环;72℃10min。

1.6 叶片酶粗液的提取

称取约0.5g新鲜叶片,用0.05mol/L pH 7.0 磷酸缓冲液在冰浴下把叶片充分研磨成匀浆,匀浆液于4℃下,4000r/min离心20min。上清液即为粗酶提取液,分装后储存于-80℃冰箱中。

1.7 抗氧化酶活性的测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定参照邵丛本等的NBT光还原方法进行;过氧化物酶(POD)活性的测定按照的方法进行;过氧化氢酶(CAT)活性的测定按Beers和Sizer的方法进行。

1.8 叶片中可溶性蛋白质含量的测定

可溶性蛋白质含量用考马斯亮蓝G2250法测定。

1.9 叶片中相对含水量的测定

含水量测定参照张志良等的实验指南进行测定。

2 结果与分析

2.1 烟草转基因苗的PCR分析

将长至3-4片叶的烟草幼苗进行PCR鉴定,获得了21株转基因阳性烟草植株,部分转基因植株PCR电泳结果如图1。

图1 烟草幼苗转基因阳性植株的PCR鉴定

注:M表示DL 2000Marker;1-2表示阳性IrrE质粒PBI121-IrrE;3表示野生型烟草;4-11表示8株独立的转基因烟草植株。

2.2 NaCl胁迫下烟草幼苗叶片抗氧化酶活性的变化

在植物体内的抗氧化防御体系中,CAT、SOD和POD是该系统中最重要的保护酶类。在200mmol/L浓度的NaCl胁迫下,野生型烟草的3种酶活性均是先上升然后下降,而转基因烟草中三种抗氧化酶活性一直持续上升然后维持在较高水平,且活性一直高于野生型烟草(如图2、3、4)。说明IrrE基因调控了植物体内抗氧化酶基因的过量表达,使三种抗氧化酶活性提高,从而在对NaCl胁迫耐受性过程中发挥了重要作用。

图2 盐胁迫对烟草幼苗叶片CAT活性的影响

图3 NaCl 胁迫对烟草幼苗叶片SOD活性的影响

图4 NaCl胁迫对烟草幼苗叶片POD活性的影响

2.3 NaCl胁迫下烟草幼苗叶片中可溶性蛋白质含量的变化

可溶性蛋白质参与植物细胞渗透势的调节,较高质量分数的可溶性蛋白质,有利于植物细胞维持较低的渗透势,抵抗高盐胁迫带来的伤害。转基因植株中可溶性蛋白质含量高于野生型烟草(如图5),推测IrrE基因表达产物影响了氨基酸的合成与分解,对高盐所造成的氨基酸破坏起到有效的保护作用。

图5 NaCl胁迫对烟草幼苗叶片可溶性蛋白含量的影响

2.4 NaCl胁迫下烟草幼苗叶片中相对含水量的变化

在200mmol/L NaCl处理烟草幼苗一段时间内(0-48h),野生型烟草的叶片相对含水量一直持续下降,而转基因烟草相对含水量在开始时下降然后持续上升,并且转基因植株叶片含水量一直高于野生型(如图6)。

图6 NaCl胁迫对烟草幼苗叶片相对含水量的影响

3 讨论

在高盐胁迫条件下,体内往往会产生大量的氧自由基,从而引起膜质的氧化伤害。为了尽量避免植物体遭受伤害,植物体内存在有抗氧化的过氧化酶系统,主要包括SOD、POT、CAT等酶。在植物体遭受盐胁迫的时候,过氧化酶系统活性加强,清除过多的活性氧。在一定范围内,随着盐浓度的增加,SOD活性也升高。其中SOD催化两个超氧自由基发生歧化反应形成O2和H2O2,产生的H2O2再由POD和CAT分解去除。现已证实提高植物体内抗氧化酶类活性及增强抗氧化代谢水平是增强植物耐盐性的途径之一。该项研究中转基因植株SOD、CAT和POD三种抗氧化酶活性在开始时持续上升,然后维持在较高的水平。推测IrrE基因表达产物直接或间接调控了SOD、CAT和POD的过量表达,三种抗氧化酶活性得以提高,从而减轻了脂质过氧化作用保护了细胞膜结构的稳定性。

盐胁迫对蛋白质的影响比较复杂,盐分抑制蛋白质合成而促进其分解,抑制的直接原因可能是由于破坏了氨基酸的合成。如蚕豆在盐胁迫下叶内半胱氨酸和蛋氨酸合成减少,从而使蛋白质含量减少。该项研究中,在盐胁迫下转基因烟草可溶性蛋白含量较野生型高,其原因可能是IrrE基因表达产物参与了蛋白的代谢过程,阻止了盐对氨基酸合成的破坏作用,维持了在盐胁迫下蛋白的正常代谢途径。叶片相对含水量是植物抗逆重要的指标之一,一般而言相对含水量高的植物抗高盐胁迫的能力要强。该项研究中野生型烟草相对含水量一直持续下降,而转基因烟草开始有所下降然后逐渐升高维持在较高水平。

因此,我们推测IrrE基因作为一种转录因子调控了高盐胁迫相关基因的表达,启动了植物抗高盐胁迫相关的一系列生理机制,从而提高了植物对NaCl胁迫的耐受能力。

参考文献

[1]王宝山,赵可夫,邹琦.作物耐盐机理研究进展及提高作物抗盐性的对策[J].植物学通报,1997,14(增刊):25-30.

[2] Gosset D.R.,Banks S.W.,Millhollon E.P.,et al.Antioxidant response to NaCl stress in a control and an NaCl-tolerant cotton cell line grown in the presence of paraquat,but lionine sulfoximine, and exogenous glutathione[J].Plant Physiol,1996,112(2):803-809.

[3] Apel K.,and Hirt H.Reactive oxygen species: metabolism,oxidativestress, and signal transduction,Annual Rev[J].Plant Biol.,2004,55:373-399.

基金项目:本研究由转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08009-091B),国家自然科学基金(30871555),教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-08-0940)和四川省教育厅(09ZA034)资助。

作者简介:奉斌(1980-),女,西南科技大学在读硕士研究生,研究方向:植物遗传学。