PED相关粪肠球菌生物膜中胞外DNA作用的研究

摘要：目的 就PED相关粪肠球菌生物膜中胞外DNA作用进行研究。方法 选择根管治疗术失败或者被诊断为顽固性根尖周炎的单根管牙，并且提取根管内粪肠球菌，鉴定粪肠球菌，制备粪肠球菌菌液，配制核酸染液。结果 实验组在培养24h后基本都没有菌胞附着，而对照组却出现了较为密集的成熟生物膜结构。在PED相关粪肠球菌生物膜的形成过程中，胞外DNA会发挥出极为重要的作用。结论 胞外DNA能够成为攻克PED相关粪肠球菌生物膜的新靶点，具有极为突出的作用效果。

关键词：PED相关；粪肠球菌生物膜；胞外DNA；作用

根管生物膜的存在是导致根管治疗术失败，以及根尖感染性疾病、牙髓感染性疾病经久不愈的主要原因，而粪肠球菌则是主要导致根管内感染治疗失败的致病菌。生物膜会让粪肠球菌长期生存于高抗菌药性、高碱性、营养物质缺乏的恶劣环境中，并且还会出现再感染的问题[1]。实验表明：PED相关粪肠球菌生物膜中胞外DNA作用极为有效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1菌株和试剂 粪肠球菌、BhI液体培养基、吖啶橙、ClED培养基、溴化已锭（EB）、DNASEI。

1.2方法

1.2.1提取根管内粪肠球菌 选择根管治疗术失败或者被诊断为顽固性根尖周炎的单根管牙。牙体髓室和表面用碘伏（20g/l）进行消毒，在根管内插入标准纸捻，在根尖孔处停留10s。然后将纸捻取出，立即浸入到移液管中（盛有琉基乙醇酸盐转送液，剂量为1.0ml），浸泡30min后送检。再用漩涡振荡器振荡1min移液管，将全部样本的剂量都调整到300μl，离心10min。再用PBS稀释，震荡混匀。在ClED鉴定培养基上接种50μl，放置在温度为37℃的环境内培养18h。

1.2.2鉴定粪肠球菌 细菌学鉴定：基于ClED鉴定培养基上菌落的颜色和形态来鉴定是否为粪肠球菌，假定直径约0.5mm、颜色的黄色的菌落为粪肠球菌。

生化反应：65g/l氯化钠肉汤、胆汁七叶苷、阿拉伯糖、甘露醇均为阳性；山梨糖、触酶均为阴性。在BhI琼脂培养基中接种菌株，保存温度为-4℃。

1.2.3制备粪肠球菌菌液 将单菌从BhI琼脂培养基（已分离纯化）取出，在BhI液体培养基中接种，并且放置在设定温度为37℃的恒温培养箱中常规培养24h，离心10min，离心速度为4000r/min。洗菌2次，再加入无菌的BhI液体培养基来配制成菌液（OD600=0.6）。取2ml菌液放置于试管中，基于NCClS标准方法来合理配制，在30min内完成，将配制好的菌液接种。

1.2.4配制核酸染液 取1mg溴化已锭、1mg吖啶橙溶于PBS溶液（Ph值为7.0，剂量10ml），配制成储备液（浓度为100μg/ml），等份混合EB储备液及吖啶橙稀释成工作液。

1.3 DNASEI对粪肠球菌生物膜形成的影响 将一个灭菌的盖玻片（规格为20mm×20mm）放入细胞培养皿（直径35mm）内，取1ml无菌BhI培养液及1ml菌液混合后滴至盖玻片表面。对照组加入2ml的BhI培养液，实验组加入2ml的DNASEI（浓度为100U/ml）。封闭方式选用封口膜，放入37℃恒温箱常规培养。在培养24h再取出，将封口膜开启，吸净液体。为了能够将表面浮游细菌去除，可再用1mlPBS洗涤2次，然后再将200μl核酸染液滴加到生物膜表面，然后黑暗室温孵育2min以便进行ClSm观察。

1.4 DNASEI对自由生长至不同时段的生物膜的影响 在6孔培养板中放入盖玻片（规格为20mm×20mm），取1mlBhI培养液和1ml标准菌液进行混合，而后滴至盖玻片表面，封闭封口膜，37℃培养6个时段（分别是48h、36h、24h、18h、12h、6h）。

1.5定量分析红绿荧光 生物膜全部区域的各个层面都用ClSm予以逐次扫描，对红绿光面积进行分别统计，进而对生物膜活性予以计算。生物膜活性=绿荧光量/绿荧光量+红荧光量。

2 结果

2.1 DNASEI对粪肠球菌生物膜形成的影响 实验组在培养24h后基本都没有菌胞附着，而对照组却出现了较为密集的成熟生物膜结构。

2.2 DNASEI对自由生长至不同时段的生物膜的影响 根管内粪肠球菌生物膜的生长活性在各个阶段都被DNASEI明显降低，与对照组存在着较为明显的差异，具有统计学意义（P

3 讨论

本研究采用溴化已锭（EB）染色剂作为胞外DNA的染色剂，溴化已锭的灵敏性较高，在检测DNA中常被使用。EB虽然不能将检测DNA直接穿过，但是却含有一个与碱基位置接近的平面基团，使得DNA与染料结合，并呈现出较为明显的荧光。共聚焦显微技术既可定位细胞内荧光，又能够定量分析细胞内荧光，，获得分布在样品不同部位的荧光强度数值及变化情况。

本研究对PED相关粪肠球菌生物膜中胞外DNA作用进行探讨过程中，利用了生物制剂DNaseI，DNaseI是一种特异性DNA水解酶。将DNaseI放置在培养皿中24h后，却基本没有菌落出现在玻片上，而24h生物膜却出现在没有放置DNaseI的玻片上，这充分说明：胞外DNA与PED相关粪肠球菌生物膜的形成密切相关[2-3]。而实验表明：早期生物膜的继续形成可被DNaseI成功抑制，能够明显分解已成熟的生物膜，这充分说明：胞外DNA对PED相关粪肠球菌生物膜成熟后的扩散增厚都有着极为重要的意义。总之，胞外DNA能够成为攻克PED相关粪肠球菌生物膜的新靶点，具有极为突出的作用效果。

参考文献：

[1]古丽莎，凌均.根管生物膜及其临床控制的研究进展[J].国际口腔医学杂志，2006，33（5）：349-351.

[2]文静，范兵.根管内粪肠球菌感染的研究进展[J].国际口腔医学杂志，2007，34（1）：13-15.

[3]倪玉华，张建军，孙宝贵.DNA酶Ⅰ的研究进展[J].国际病理科学与临床杂志，2006，26（6）：531-535.编辑/金昊天