探讨实时荧光定量PCR检测过程应注意的几个问题

【中图分类号】TH744.16 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2012)09-0114-01

实时荧光定量聚合酶反应（FQ-PCR）是一种高度灵敏的核酸检测(NAT)技术，它采用实时检测技术，连续不断的检测PCR过程中反应体系对荧光信号的变化，利用荧光信号达到了某一阈值时的循环次数与起始模板DNA量的对数值之间的严格的线性关系，进行起始模板定量，可真实反应病毒的复制情况，具有特异性强、敏感性高、精确性好的优点。它同时采用完全闭管检测有效地减少实验过程中产生的交叉污染，在疾病的诊断、治疗、疗效的观察中具有十分重要的意义。但由于它高度的敏感性，又导致了PCR技术不可忽视的弱点——结果的准确性。以下就影响此问题的几个注意事项，浅谈一下自己的观点，供同行参考有不足之处请见谅。

1 加量误差

加样是每个实验操作过程中最基本的一项操作技能，受人为因素影响最大，是直接影响检测结果的关键环节。众所周知，定量PCR的灵敏度高，可达10个数量级，每一条双链DNA模板经过高温(95℃)变性、低温(37℃～55℃)退火、适温(72℃)延伸三个步骤变成2条DNA，每条DNA分子又成为下一次反应的模板，每次循环后，其DNA特异区拷贝数增加一倍。如此反复进行，PCR产物得以2n数量迅速增加。若吸头多沾一点，就可能改变整个反应体系的成分比例，从而影响PCR扩增的准确性。

对于此类问题，首先应寻找操作人员的自身原因。每个FQ-PCR操作者必须具备该技术的基本知识和所需的基本操作技能，能清醒地认识实验操作过程中各个环节的具体要求，准确吸取各反应成分，并严格按照规范化程序进行操作并采取有效的预防措施，在反复的实践过程中熟练和领悟，以达到一个操作技术的稳定过程。其次，使用加样器时，应定期进行校准，避免反复调档，以减少系统误差，保证加量的准确。若需调档应顺时针缓慢调动，对常用量应设专档专用。

2 标本的采集、处理与保存

2.1 标本收集要注意的重点是，所收集的临床标本一定要正确和采集的时间合适。这点每个操作者都应与临床的医护工作者多沟通，才能提高标本的送检合格率，满足分析前的质量控制，提高阳性检出率。

2.1.1 在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能影响结果的检出，因此，操作者应了解感染性疾病的发生、发展、疗效、预后是一个动态的变化过程，不同时期的实验数据发挥着动态监测的作用，为临床医生对病情疗效作出了合理的解释提供依据，指导治疗。

2.1.2 标本采集部位不同，所测得结果不同，临床意义也有所区别，通常我们根据所测病原体定标本的类型和采集量，并严格按相关操作规程进行正确的取材，这样才能为疾病的确诊提供真实准确的检测数据，提高检测的阳性率和准确率。

2.2 标本处理：标本的处理对FQ-PCR测定核酸模板的成功提取具有决定性作用，是实验操作成功与否的又一关键环节。此过程主要为手工，在操作中一定要格外小心，严防交叉污染，避免吸入杂质，特别是每类标本都有各自标准化的处理程序，严格遵循每个步骤的要求尤为重要。另外，一次性用品的选择很重要，如离心管、吸头的质量一定要严格要求，严格消毒，避免杂质及其它病原微生物成为扩增的对象造成结果的偏差。

2.3 适当的保存：标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要。标本采集后应立即送检，不同标本的保存方法各异，若不能及时检测通常在-20℃～-70℃ 的条件下保存，避免反复冻融，若冻融1次病原数量明显减少从而影响测定结果的准确性下降。

3 结果的判定

在判断结果时应注意对于一次阳性或阴性结果，不能简单地给予肯定或否定，一是检出的微生物是否为真正的病原体，二是病原体是过路客还是真正病因．是否达到致病的数量；一般要对照联合检查的其它有关免疫和生化指标，与临床医师沟通，考虑诸多因素，认真分析，综合判断，才能使临床医生不因PCR检测结果的误差而产生误诊。

综上所述，FQ-PCR操作者应认真对待实验过程中的每一步操作，每个小细节，保持严谨的工作态度，与临床的医护工作者一同学习一同探讨，务必做到实验的标准化、合理化、细致化和有效化，保证标本采集正确，实验操作精确，结果判断准确，这才是PCR技术的需求，这对于刚接触此项工作的初级人员来说尤为重要。

参考文献

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