时间：2022-09-13 09:46:22
摘要：用反相高效液相色谱法测定了潮州产余甘子鲜果中没食子酸的含量,以Agilent ZORBAX Eclipse XDB~C18为分析柱,进样量为10μL,甲醇-0.1%的磷酸溶液（20∶80）为流动相,流速为1mL/min,检测波长为273nm进行分析检测,结果表明：没食子酸的出峰时间为2.471min,采用外标法进行定量,在没食子酸浓度为2~10mg/L 范围内与峰面积有良的线性关系,相关线性系数达到0.999 2,加标回收率为96.31%~101.52%平均加标回收率为98.27%,RSD= 1.86%（n=6）.此方法能快速、准确地测定余甘子鲜果中没食子酸的含量,且重复性好。
关键词：反相高效液相色谱；余甘子；没食子酸
中图分类号：R282.71文献标识码：A文章编号：16749944(2011)04021603
1 引言
余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子(Phyllanthus emblica L.)的成熟果实［1］,别名油柑子,主要产区为云南、广西、广东、福建、海南等年平均气温为20℃的省份,果实于冬季至次春成熟时采收,其果味甘、酸、涩,具有清热凉血,消食健胃,生津止咳等功效,子是藏族民间习用药材,其含有非常丰富的维生素C,多种氨基酸和鞣质,其中没食子酸为其主要活性成分［1~5］,据现代药理研究表明：其具有清除自由基和抗氧化作用、降血脂及抗动脉粥样硬化、抗肝损伤作用、抗诱变、抗致畸和抗肿瘤等作用［2］。
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂药品
Agilent 1200系列HPLC,配VWD检测器；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；万分之一电子分析天平(型号：FA2004,上海精密科学仪器公司)；没食子酸对照品（ 深圳市时得佳科技有限公司,CAS No:149~91~7）；甲醇为色谱纯（Fisher science,购于广东省广州市自力色谱有限公司）；水为怡宝饮用纯净水；磷酸为分析纯试剂。
2.2 实验材料
实验材料为潮州本地产余甘子。
2.3 色谱条件
色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB~C18柱（4.6×150mm,5μm）,进样量10μL,流动相A为0.1%的磷酸,B相为甲醇,A相∶B相=80∶20；流速为1mL/min;柱温为25℃；VWD检测器,检测波长为273nm;分析时间为10min。
2.4 标准溶液的配制
2.4.1 标准贮备液的制备
用电子分析分平精确称取没食子酸20mg,用甲醇溶解并准确写容于100m棕色的容量瓶中,配制浓度为200mg/L的标准贮备母液,于4℃冰箱下保存备用。
2.4.2 标准工作液的制备
为了保证样品检测的浓度落在校正曲线内,用单点校正的方法大体估算了样品最后的浓度（大概在2~4mg/L之间）。故选取2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mg/L5个点作一校正曲线,其配制方法为准确移取标准贮备母液1.25mL于25mL容量瓶中,并以甲醇定容至刻度,得到10mg/L的标准工作液,摇匀。并以此标准工作液作为母液,精确移取一定的体积,以甲醇作为稀释液,配制浓度分别为2.0,4.0,6.0,8.0,10.0mg/L的一系列的标准工作液。
2.5 样品溶液的制备
准确称取去核的余甘子鲜果2.0g于研钵中,加入少量甲醇研磨成匀浆,匀浆毫无损失的移入一个50ml容量瓶中,并用少量甲醇多次洗涤研钵,最后用甲醇定容至刻度,后把甲醇提取液转移至一具塞锥形瓶中,盖上塞,分析天平上准确称重,后于超声波清洗器中提取60min后,放冷,用甲醇补足重量,过滤,过滤液经0.45μm的微孔过滤膜过滤后,上样分析检测。
3 实验结果与分析
3.1 色谱条件
3.1.1 VWD检测波长的选择
没食子酸检测波长在文献中多为报道为272nm［3］和273nm［1,4,6,7,8］,故以这两个波长作为实验波长选择,结果表明,当在其它检测条件相同的情况下,273nm下出峰的峰面积要比270nm下出峰的峰面积大,考虑到灵敏度的因素,故选择273nm作为没食子酸的检测波长。
3.1.2 液动相的配比的选择
没食子酸在酸性条件下较为稳定,加入少量酸性物质有助于没食子酸峰形的改善,故以甲醇与0.1%的磷酸不同的配比作为流动相,文献报道,有以甲醇：0.1%的磷酸（5∶95）为流动相的［8,9］,也有以甲醇：0.1%的磷酸（10∶90）为流动相的［6］,笔者在实验过程中发现,甲醇比例比较低时,容易导致出峰不明显或者不出峰,出峰时间也较晚,而过高则出峰太快,影响分析且峰有前伸现象,经过实验,结果表明当流动相配比为20∶80下,没食子酸出峰,峰形好,高斯对称,分离度大于1.5.故选择当甲醇：0.1%的磷酸为20∶80作为没食子酸检测的流动相。
3.1.3 柱温及流速
流速不宜过快,也不宜太慢,以0.5mL/min,0.8mL/min,和1mL/min流速实验发现,流速1mL/min,保留时间为2.417min,因甲醇的吸收波长为205nm,在273nm下不存在溶剂峰的影响,故选择出峰时间较短的1mL/min的流速为洗脱溶剂的流速,柱温在25℃和30℃实验下发现,对出峰没有多大影响,但考虑到有些分析仪器没有柱温箱,故选择接近于室温的25℃为柱温箱温度。
3.2 没食子酸标样及潮州柑鲜果样品溶液色谱图
在1.3色谱条件下,将标准贮备液及处理好的样品溶液上样分析,结果见如图1、图2。
从图1和图2可以看出,没食子酸的出峰时间为2.471min,峰形好,对称性好,从样品溶液出峰情况来看,在没食子酸的出峰的前后没有别的杂质峰影响其出峰,即分离度能达到分析检测的要求,且能基线分离,为外标法的准确定量提供基础。
3.3 标准曲线及其线性考察
将2.4.2配制好的系列标准工作液按1.3 色谱分析条件进样分析,并以峰面积为纵坐标,标准溶液的浓度为横坐标,进行线性回归,其结果见图3。
从图3可知,在质量浓度为2~10mg/L的范围内呈现良好的线性关系,线性回归方程为：
y=24.273 8x+42.249 6.
相关系数r=0.999 2。
3.4 方法精密度
在选定的色谱分析测定条件下,对质量浓度为10mg/L的标准工作液连续进样分析6次,计算每次出峰的峰面积及其保留时间,结果见表1。
3.5 方法的加标回收率实验
精确称取去核余甘子鲜果大约2.000g共3份于3个研钵中,加入浓度为200mg/L的标准贮备1mL,然后再按1.5样品溶液的制备的方法制备样品溶液,每1份制备的样品溶液上样分析3次,加标回收率结果见表2。
由表2可知,没食子酸的加标回收率在96.31%~101.52%之间,平均为98.27%,RSD=1.86%,说明本测定方法准确可靠。
4 结语
本实验利用高效液相色谱法测定了潮州产余甘子鲜果中没食子酸的含量,测定含量约为7.5mg/100g,测定精密度RSD＜2%,加标回收率在96.31%~101.52%之间,RSD=1.86%.用该法测定潮州产余甘子鲜果中没食子酸的含量,无干扰,方便,快速,线性良好,准确度高,且重复性好。
参考文献：
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Determination of Gallic Acid in Phyllanthus Emblica L Pulp from Chaozhou byRP-High Performance Liquid Chromatography
Liu Zhicong,Tang Weiping,Chen Guilin
（Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China）
Abstract:In this paper,the content of gallic acid in phyllanthus emblica L pulp from Chaozhou is determined by RP-HPLC,which takes Agilent ZORBAXEclipse XDB－C18 as analytical column,the inject volume is 10μL,and takes phosphoric acid(20:80)with -0.1% methanol as mobile phase,flow rate is 1ml/min,and the detection wavelength is 273nm.The results show that the peak time of gallic acid reaches 2.471min,and with external standard method for quantitative,the peak time of gallic acid has a good liner relation with the peak area of gallic acid when the concentration of gallic acid is in the range of 2 to 10μg/mL,and the relevant linear coefficient reaches 0.9992(n=5),the adding standard recovery are 85.76%～101.52%,the average recovery is 92.61%，and RSD= 5.73％(n=6).It is proved that the method can rapidly and accurately determine the content of gallic acid in phyllanthus emblica L pulp,and also has a good repeatability.
Key words: RP-HPLC;Phyllanthus emblica L;Gallic acid