单叶蔓荆总黄酮的提取工艺研究

摘要：以提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数为考察因素，以单叶蔓荆（Vitex rotundifolia L.）总黄酮得率为考核指标，应用正交试验对其提取工艺进行优化。结果表明，单叶蔓荆中总黄酮的最佳提取工艺为提取温度70 ℃、时间1 h、固液比1∶12（m∶V）、乙醇体积分数70%。该提取工艺简单、高效，适用于单叶蔓荆的总黄酮提取。

关键词：单叶蔓荆（Vitex rotundifolia L.）；总黄酮；正交试验；提取工艺

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）05-1163-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2015.05.034

Abstract： The technology of extracting total flavonoids from Vitex rotundifolia L. was optimized by orthogonal experiment with the content of total flavonoids as index. The results showed that the optimal conditions were the ratio of solid to liquid of 1∶12（m∶V）， 70% ethanol， 1 hour of reflux at 70 ℃. The technology is simple and rapid for extraction of total flavonoids from Vitex rotundifolia L..

Key words：Vitex rotundifolia L.；total flavonoids；orthogonal experiment；extraction technology

牡荆属（Vitex L.）植物为马鞭草科灌木或乔木，主要分布在热带及温带地区。在我国有14种，主要分布在长江以南地区，在东北、华北、西北等地也有少量分布[1]。单叶蔓荆（Vitex rotundifolia L.）为牡荆属马鞭草科，辛苦微寒，具清利头目、疏散风热等功效，民间常用于头痛、眼痛、感冒等病症的治疗[2-7]。研究表明，单叶蔓荆的化学成分主要包括黄酮类、倍半萜、二萜类、三萜类、苯丙素类、甾类等物质[3-7]，其中黄酮类化合物为其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、镇痛等多种药理作用[5-11]。因此，研究单叶蔓荆中总黄酮的提取工艺具有重要意义。

本试验采用正交试验对单叶蔓荆提取工艺进行优化，对影响提取的各种因素及条件进行了探讨，旨在为单叶蔓荆的综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

单叶蔓荆由烟台益生堂药业有限公司提供，经滨州医学院药学院天然药物实验室鉴定为单叶蔓荆。

1.2 仪器

U-190型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；JA5003B型电子天平、DHG-9053型真空干燥箱（上海精密仪器仪表有限公司）；THH-6型恒温水浴锅（上海乔跃电子有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水式多用真空泵、RE-301型旋转蒸发仪（巩义市瑞德仪器设备有限公司）。

1.3 试剂

芦丁对照品（中国药品生物制品检定所），其他试剂均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 单叶蔓荆中总黄酮含量的测定

1）供试样品溶液的制备。准确称取单叶蔓荆粗粉30 g，于1 000 mL烧瓶中，按要求加入不同体积分数乙醇溶液，加热回流提取一定时间，过滤，减压回收溶剂，干燥，称重，得到单叶蔓荆干膏。精确称取在不同提取条件下得到的单叶蔓荆干膏10 mg，于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容后备用。

2）标准溶液的制备。精确称取于120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，于100 mL容量瓶中，加60%乙醇30 mL，水浴微热使其完全溶解，放冷，60%乙醇定容至100 mL，制成0.100 mg/mL芦丁对照品溶液。

3）标准曲线的绘制。分别精确吸取芦丁对照溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分别加入25 mL容量瓶中，各加0.75 mL亚硝酸钠溶液（50 mg/mL），摇匀，静置10 min；再加入0.75 mL硝酸铝溶液（100 mg/mL），摇匀，静置10 min；再加10 mL氢氧化钠溶液（40 mg/mL），60%乙醇定容，摇匀，静置10 min。于510 nm波长处测吸光度，以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标，绘制标准曲线。

4）精密度试验。精确吸取2.0 mL芦丁对照溶液于25 mL容量瓶中，按标准曲线绘制方法，平行操作5次，测定该方法的精密度。

5）稳定性试验。取适量供试溶液，按标准曲线绘制方法，于0、2、4、6、8 h分别测定其吸光度，测定该方法的稳定性。

6）重复性试验。取同一批药材，按照以上方法制备供试样品溶液，并按标准曲线绘制所述方法测定吸光度，平行操作5次，测定该方法的重复性。

7）回收率试验。精确吸取6份已知含量供试样品溶液各0.5 mL，加入芦丁标准品溶液，按标准曲线绘制方法测定其吸光度，计算单叶蔓荆总黄酮的含量。

供试样品总黄酮含量测定：精确吸取5 mL供试样品溶液于25 mL容量瓶中，按标准曲线绘制项方法测定其吸光度，并代入回归方程，计算单叶蔓荆总黄酮的含量。

1.4.2 正交试验 为寻找最佳的提取条件组合，在单因素试验结果[单因素最佳条件为提取次数3次、提取温度60 ℃、提取时间2 h、固液比1∶10（m∶V，下同）和乙醇体积分数70%]的基础上，应用正交试验设计，选择了主要影响提取效果的提取温度（A）、提取时间（B）、固液比（C）和乙醇体积分数（D）作为考察因素，每个因素选择3个水平，以总黄酮含量作为考核指标，按照L9（34）正交设计方案进行试验，正交试验因素及水平见表1。

1.4.3 验证试验 采用筛选后得到的最佳工艺，进行验证试验，3次重复，按标准曲线绘制方法测定其吸光度，计算单叶蔓荆总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析，得到的回归方程为A=0.057 0C-0.008 3（r=0.999 8）。结果表明，芦丁在0.004～0.045 mg/mL浓度范围与其吸光度呈良好的线性关系。

精密度试验结果表明，该测定方法RSD=0.28%，表明其精密度良好。稳定性试验结果表明，该测定方法RSD=1.27%，表明在8 h内测定供试样品，其总黄酮含量基本稳定。重复性试验结果表明，该测定方法RSD=1.52%，表明该方法具有良好的重复性。回收率试验结果表明，单叶蔓荆总黄酮平均回收率为99.29%，RSD=1.35%，表明该方法可行。

2.2 单叶蔓荆总黄酮提取工艺优化

2.2.1 正交试验结果 正交试验试验结果见表2，方差分析结果见表3。结果表明，影响单叶蔓荆总黄酮提取的主次因素依次为A、D、C、B，即提取温度、乙醇体积分数、固液比、提取时间。方差分析结果表明，因素A和D对试验结果有极显著影响，因素C对试验结果有显著影响。按照方差分析结果，只对有显著影响因素选择最佳水平，而试验结果影响不大的因素则按照实际需要选择合适的水平。因此，单叶蔓荆总黄酮提取最佳工艺确定为提取温度70 ℃、提取时间1 h、固液比1∶12、乙醇体积分数70%，即A3B1C3D2。

2.2.2 验证试验 验证试验结果表明，单叶蔓荆总黄酮的含量分别为2.50、2.49、2.52 mg/g，平均含量为2.50 mg/g，RSD=0.63%（n=3），表明该工艺条件稳定、可靠。

3 小结与讨论

在前期单因素试验中，对单叶蔓荆总黄酮提取过程中粒度、提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数单因素进行筛选，结果单叶蔓荆粒度对提取效率的影响很小，因此选择对提取效率有较大影响的提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数为考察因素，进行正交试验，优选其最佳提取条件。经正交试验结果分析，发现影响单叶蔓荆总黄酮提取主次因素依次为提取温度、乙醇体积分数、固液比、提取时间。经综合分析各种因素，选定A3B1C3D2为单叶蔓荆总黄酮最佳的提取工艺，即提取温度70 ℃、提取时间1 h、固液比1∶12、乙醇体积分数70%，按此条件提取，总黄酮含量达到2.50 mg/g，并通过验证试验表明该提取工艺稳定、可靠。

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