江西峡江椪柑果梗炭疽病病原鉴定

摘要 从江西省峡江县椪柑园采集呈典型症状的椪柑果梗炭疽病病样，经病菌分离纯化获得3个炭疽病菌株X-1、XJ-2和XJ-3，对这3个菌株进行了形态特征观察、rDNA-ITS序列测定和特异性引物PCR扩增。结果表明，这3个菌株均为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），依照柯赫氏法则验证了胶孢炭疽菌为椪柑果梗炭疽病的病原菌。

关键词 柑橘 椪柑 果梗炭疽病 胶孢炭疽菌 病菌分子鉴定

江西省峡江县椪柑栽培面积较大，所产椪柑皮薄易剥，酸甜适度，化渣爽口，深受消费者青睐。近年来，随着椪柑生产在峡江县的不断发展，椪柑病害问题日渐凸显，其中，椪柑果梗炭疽病发生严重，给部分果园造成了较大的经济损失。椪柑果梗炭疽病是柑橘炭疽病的特例，该病侵染椪柑时，与侵染其他柑橘品种引起树体不同部位发病不同，该病常常只为害果梗，受害果梗枯黄、干缩，极易导致落果发生。据报道，引起柑橘炭疽病的病菌主要有3种，即胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeos-porioides）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）和平头炭疽菌（C.truncutum），其中胶孢炭疽菌是主要的优势群体。目前，引起峡江县椪柑果梗炭疽病的病原菌种类归属尚不清楚，为此，我们利用传统的形态学方法，结合现代分子生物学技术，对椪柑果梗炭疽病病原菌进行了较系统的鉴定，以期为该病的有效防治和进一步研究打下良好基础。

1 材料与方法

1.1样品采集

于2011年11月中旬椪柑果梗炭疽病发病高峰期，赴峡江县水边椪柑园采集呈典型症状的发病果梗。果园窄长形，南北走向，面积约2hm2，在果园北、中、南3个方位各取样1个，共3个样品，样品带回实验室后迅速进行病菌分离。

1.2病菌分离与纯化

按常规组织分离法，用PDA培养基进行病菌分离，待菌落长至适当大小，取边缘菌丝体进行病菌纯化。将分离获得的3个菌株XJ-1、XJ-2和XJ-3分别转接于PDA平板中央，25℃黑暗培养，逐日观察记载菌落特征并测量菌落生长速率，待分生孢子产生后，随机取50个分生孢子进行形态观察和大小测量。每个菌株重复3次。

1.3病菌基因组DNA提取

分离病菌转接PD液体培养基，25℃振荡培养3～4天，收集菌丝体，用CTAB法提取病菌DNA。用1%琼脂糖凝胶检测提取的DNA质量。

1.4病菌rDNA-ITS序列扩增、测序及序列分析

采用真核生物通用引物ITS1/ITS4扩增rD-NA ITS序列，ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3′）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应体积为50μL，依次加入：ITS1（10pmoL）1μL，ITS4（10pmol/L）1μL，dNTP Mix Solution（2.5mmol/L）4μL，10x Taq Plus Buffer 5μL，Taq Plus DNA Poly-merase 0.5μL，DNA模板2μL，ddH2O 36.5μL，混匀后进行PCR扩增。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃补平10min。PCR产物通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化有限公司）进行纯化回收后，送至上海捷瑞生物工程有限公司进行测序，获得的序列递交NCBI数据库进行序列鉴定，用计算机分析软件DNAStar（Madison Wisconsin，USA）进行序列分析及同源性比较。

1.5病菌特异性引物的PCR扩增

采用特异性引物CgInt/ITS4和CaInt2/ITS4分别对提取的DNA模板进行PCR扩增，其中CgInt/ITS4特异于胶孢炭疽菌，CaInt2/ITS4特异于尖孢炭疽菌。这2对引物的反向引物均为ITS4，正向引物则不同，胶孢炭疽菌为CgInt（5′-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3′），尖孢炭疽菌为CaInt2（5′-GGGGAAGC-CTCTCGCGG-3′）。除引物不同外，PCR反应体积、反应成分均与本节1.4中的相同，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火75s（CgInt/ITS4）或69℃退火75s（CaInt2/ITS4），72℃延伸1min，30个循环；72℃补平10min。PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果。

1.6病菌回接及再分离

用无菌水将纯培养产生的黏孢团配制成每毫升105～106个分生孢子的悬浮液，采用针刺法，接种健康的椪柑果梗，每个分离物重复接种3根果梗，另设无菌水作对照，接种果梗放在灭菌的瓷盘中保湿，置于25℃培养箱中培养，定期观察，记录发病时间和症状。从表现症状的果实上再分离培养病菌，以鉴定是否与原接种菌一致。

2 结果与分析

2.1病菌形态特征

在PDA培养基上，3个菌株菌落基本特征相同。菌落初为白色，后期从中央开始颜色逐渐加深至灰绿色，菌落边缘整齐，菌丝稠密，呈绒状，菌落生长速率为12.0～15.3mm/天，7天可长满整个平板，培养后期在菌落中央产生橘红色黏孢团。黏孢团为群集的分生孢子，分生孢子长椭圆形，无色，两端钝圆或尖，大小为13.0～18.1μm×4.0～5.3μm。

2.2病菌rDNA-ITS序列扩增、测序及序列分析

采用CTAB法，从3个待鉴定的菌株中均提取到质量较高的基因组DNA。以基因组DNA为模板，对上述3个菌株的rDNA-ITS序列分别进行PCR扩增，均获得了大小约560bp的DN段（图1），测序结果表明该片段实际长度为536bp（不含两端引物序列，基因登录号JQ629919-JQ629921），将该序列与GenBank中已有序列进行同源性比较，结果与胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeospori-oides）的同源性最高，达100%。

2.3病菌特异性引物的PCR扩增

分别用胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌特异性引物CgInt/ITS4和CaInt2/ITS4对3个菌株的基因组DNA进行PCR扩增，结果用胶孢炭疽菌特异性引物CgInt/ITS4从供试的3个菌株中均扩增得到一条长约450bp的条带，符合预期大小（图2），而用尖孢炭疽菌特异性引物则扩增不出预期的条带。

2.4病菌回接及再分离

椪柑果梗接种病菌3天后，接种部位产生椭圆形、浅褐色、稍凹陷的病斑，第6天大多数病斑扩展为长达2cm的椭圆形大斑，病斑上产生数目不等的橘红色小点，镜检为病菌的分生孢子盘和分生孢子，分生孢子形态与原病菌相一致。从接种发病的病斑中又分离到与原病菌培养性状和形态特征相一致的病菌。

3 小结与讨论

柑橘炭疽病是影响柑橘生产的重要病害，给柑橘产业造成了严重的经济损失。本研究通过病菌分离、病菌形态特征观测、rDNA-ITS序列测定及特异性引物PCR扩增，对江西省峡江县椪柑果梗炭疽病病原菌进行了鉴定，明确了该病原菌为胶孢炭疽菌。

据报道，引起柑橘炭疽病的病菌有胶孢炭疽菌、尖孢炭疽菌和平头炭疽菌3种，其中平头炭疽菌的分生孢子为新月形，胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的分生孢子均为短棍棒形。虽然一般认为胶孢炭疽菌的分生孢子两端钝圆，尖孢炭疽菌的分生孢子两端较尖，但有时很难界定，因此，有必要对病菌作进一步的分子鉴定。rDNA-ITS序列测定及分析表明，江西省峡江县椪柑果梗炭疽病病原菌与胶孢炭疽菌rDNA-ITS序列同源性达100%，同时，我们还采用了特异性引物CgInt/ITS4和CaInt2/ITS4对其进行了PCR扩增，其结果也为胶孢炭疽菌。因此，江西省峡江县椪柑果梗炭疽病病原菌被鉴定为胶孢炭疽菌是明确可靠的。