耐力训练对肌球蛋白重链的影响及MyoD、Myogenin的调控作用

摘要：为了解耐力训练对肌球蛋白重链(MHC)组成及生肌调节因子MyoD和Myogenin表达的影响，探讨MyoD和Myogenin表达与MHC转换的关系，选用雄性SD大鼠20只，随机分成安静对照组(10只)和耐力训练组(10只)。耐力训练组进行跑台练习：跑台坡度10°，跑速20m／min，每天1次，每次1h，每周训练6d，28d后取浅层胫前肌。SDS-PAG正方法测定MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱx、Ⅱb蛋白组成；RT―PCR测定MHCs及MyoD、MyogeninmRNA表达。结果：耐力训练没有改变MHCs蛋白表达，耐力训练后Ⅱx―MHCmRNA表达显著减少(P

关键词：肌球蛋白重链；生肌调节因子；耐力训练

中图分类号：G804.7

文献标识码：A

肌球蛋白是骨骼肌细胞中表达最多的蛋白，占总蛋白的25%。天然的肌球蛋白由6条多肽链组成，这6条多肽链包括两条重链和两对不同的轻链。肌球蛋白重链(Myosin heavychain，MHC)分子质量约为200 000 u两对不同的轻链分别为碱性轻链和调节轻链。肌球蛋白因其具有ATP酶活性，所以又称肌球蛋白Ca2+-ATP酶。

快肌和慢肌的最大缩短速度与肌球蛋白高低的Ca2+-ATP酶活性相关[1]。这主要由于快慢肌所表达的MHC类型不同。快型肌纤维含有快型MHC异型体，表达为高的肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性，同样，慢型肌纤维含有慢型MHC异型体，表达为低的肌球蛋白Ca2+-ATP酶活性。研究肌肉肌球蛋白重链组成对于了解肌肉收缩特性有重要意义。

研究表明，肌肉MHC组成是可以发生改变的，这些因素包括胚胎发育、神经交叉支配、激素、运动、非活动性因素等等。但调控MHC表达的机制一直不很清楚。

最近有报道显示，生肌调节因子(Myogenic regulatoryfactors，MRFs)参与胚胎期肌发生过程，并在成年骨骼肌中选择性表达。因此，研究MRFs对于了解MHC转变机制具有积极的意义。

生肌调节因子属于碱性螺旋一环一螺旋(bHLH)转录调节因子，可以结合DNA，调节基因的转录，由MyoD、myogenin、myf5、MRG4个蛋白组成。MRFs可与E盒(E蛋白)形成异二聚体，这个异二聚体反过来结合到E盒特异的DNA序列上，转录调节DNA的表达。这个E盒序列已被检测为CANNTG(N为任意碱基)，在几个肌肉表型蛋白的调控区，如快肌球蛋白的轻链、MHC Ⅰ和MHCⅡh[2]、肌钙蛋白Ⅰ和desmin上都有E盒的存在。

1材料与方法

1．1 实验动物

雄性SD鼠20只，体重(232±10)g，由河北医科大学实验动物中心提供。动物随机分成两组，安静对照组10只(C)、耐力训练组10只(T)，均分笼饲养，自由饮水进食，室内温度(22±3)℃。

1．2运动方式

耐力训练组首先熟悉跑台，每天进行递增的跑台练习(跑速10～20m／min，持续时间10～60min／d)，5d后正式开始训练。跑台坡度10°，跑速22 m／min，持续时间60 min／d，运动强度约70％～75％VO2max。跑台训练共计28 d。

1．3主要试剂和仪器

(1)骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成：(SDS―PAGE方法，参照Talmadge[3]) 仪器：LKB 2301 Macrodrive 1,Power Supply；LKB 2050Midget Electrophoresis Unit．

试剂：SDS为BIOMOL公司产品，优级纯；Tris为AUGUS公司产品，超级纯；TEMED、β巯基乙醇为SERVA公司产品，研究级。

(2)骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx／d、Ⅱb4个亚型及MyoD、myogenin的mRNA基因表达：(RT-PCR方法)

试剂：逆转录酶(M-MLV)、Oligo(dt)、dNTP为Promega公司产品，Taq酶为Takara公司产品，PCR引物由北京奥科生物技术有限责任公司设计、合成。

1．4实验步骤

(1)肌肉组织提取：训练28 d的鼠用戊巴比妥钠实施麻醉(50 mg/kg)，剥离出白色胫前肌浅层(TA)迅速投于液氮中保存待用。

(2)肌球蛋白提取：1)快速称取浅层胫前肌100 mg，置于1．9 mL匀浆液中(匀浆液成分：300 mmol／L KCl、150 mmoL／L K2HPO4、10 mmol／L ATP、2 mmol／L EDTA、2 mmol／LDTF．pH 6．8)。2)手动匀浆，制备好的匀浆轻轻振荡30 min。3)以20 000 dmin低温离心20 min。4)取上清加入饱和(NH4)2SO4至33％饱和度，静置20 min。5)再以12 000 r／min离心15 min，获得沉淀即为肌球蛋白。6)收集沉淀于l mL咪唑缓冲液中(600 mmol／L KCI,10 mmol／L咪唑pH 6．8)，1000 mL 10 mmol／L咪唑(pH 6．8)透析24 h。所有操作均在4℃条件下进行。

SDS-PAGE检验肌球蛋白提取情况。

(3)骨骼肌肌球蛋白重链(MHC)蛋白组成：(SDS-PAGE法，参照Talmadge1993)。

(4)骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx、Ⅱh 4个亚型及MyoD、myagenin的mRNA基因表达。

总RNA提取参照Trizol说明书。引物设计见表1。

1．5统计分析

采用SPSS11．5统计软件，利用多因素方差一般线性模型(GLM)LSD方法检验各组间的差异，P

2结果与讨论

2．1 运动对浅层胫前肌肌球蛋白重链蛋白组成的影响

由表2所见，SDS-PAGE方法结果显示耐力练习组(T)与对照组(C)比较，Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和ⅡbMHC蛋白表达的百分比没有明显差异，即耐力训练不改变MHC的蛋白组成百分比。

耐力训练是一种增加负荷的训练，学者们通常认为耐力训练会引起快型MHC向慢型转化。如有观察大鼠轮跑4周比目鱼肌I型MHC显著增加。Demirel等[4]对于SD大鼠75％强度跑台训练10周的实验注意到训练时间>160 mi。时比目鱼肌MHCI显著增加，同时MHCⅡa下降。Wi。tar鼠耐力练习(20m／min，60min／d)的研究显示，4周的耐力练

习足底肌MHCⅡh下降的同时MHCⅡa明显增加[5]。

也有研究显示，耐力训练不改变肌纤维和MHC组成。Perhonen等[6]。Wistar跑台训练，肌原纤维ATPase方法测得的趾长伸肌和比目鱼肌肌纤维组成无明显改变。Wistar，鼠的游泳训练不影响比目鱼肌肌纤维类型分布。Demirel等的实验中，当训练时间为每天30rain和60min时，没有观察到足底肌MHC蛋白组成的改变，但训练时间延长至90 mi。时观察到MHC组成的改变。Gollnick等[7]提出耐力训练后，人骨骼肌氧化潜能增加，但肌原纤维ATPase染色显示的快慢肌纤维比例没有改变。

本实验观察到跑台的耐力训练没有影响SD大鼠胫前肌MHC蛋白组成。

耐力训练对MHC的影响可能既取决于特异的肌肉又依赖于训练的量。不同肌肉肌纤维组成不同，运动中募集顺序不同[8]。随着训练时间的延长，会有越来越多的快运动单位被募集来补偿肌肉收缩的疲劳。短时间的次最大强度跑练习中，比目鱼肌较足底肌和趾长伸肌血流量更多也能说明运动过程中慢肌首先被动员，因而耐力训练对快慢肌的影响会存在差异。

肌球蛋白转换需最小的训练持续时间，这一观点已被Salmons[9]详细阐述过，这一理论简单说是活动水平必须超过肌球蛋白异型体发生的变化。我们的耐力训练的实验没有观察到MHC的改变，这可能与训练强度和持续时间都有关，如果适当提高跑台速度、延长训练时间也许会观察到MHC快型向慢型的转化。

2．2运动对骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱ a、Ⅱ x、Ⅱb4个亚型mRNA

表达的影响

RT-PCR图象如图1所示：

表3可知，RT-PCR方法显示耐力训练使MHC一ⅡxmRNA表达减少(P

关于耐力训练影响MHC组成的研究多集中于SDS-PAGE测得的蛋白水平的报道，或者肌原纤维ATP酶疗法检验肌纤维组成的改变。本文RT-PCR方法测定的各种MHC mRNA是在转录水平观察MHC的变化，转录是蛋白合成的前提，转录水平的变化为蛋白水平的改变提供可能性。本实验RT-PCR结果显示，耐力训练使MHC一ⅡxmRNA表达显著下降，MHC一Ⅱa mRNA表达不显著增加。MHCmRNA的这种变化趋势与以往对MHC蛋白组成的报道一致[1]。但本研究中MHC蛋白水平和mRNA水平的改变不一致。原因可能在于mRNA的增加能在刺激的即刻发生，其半衰期约为2-3 d，而相应蛋白的半衰期为2―3周[11]，MHC表型的表达可能是MHC mRNA与蛋白不同时机上调和下调的结果。因而MHC表型表达与MHC mRNA间会出现错配的现象。除此之外，翻译或翻译后机制的调控也妨碍mRNA准确地表达蛋白活性。

2．3运动对骨骼肌MyoD和myogenin mRNA表达的影响

本研究结果显示耐力训练使myogenin和MyoD mRNA表达均显著下降(P＜O．01)；myogenin／MyoD由于样本量少，且个体差异大，两组间没有显示出统计学上的显著差异(见表4)。

特异表型蛋白在不同收缩活动水平的协调表达，存在着共同的调节机制。一些研究证实，生肌调节因子(MRFs)在其中起重要作用。MRFS参与原始肌细胞的分化，在成年骨骼肌纤维的表达中也起重要作用。特别是MyoD与Mvogenin的相对表达是肌肉表型表达的决定因素。快肌纤维中MyoD表达相对较高，慢肌纤维中水平较低；Myogenin情况正好相反。MyoD与Myogenin的相对表达也表现在收缩引起肌肉表型改变的调节上。

体外刺激培养的肌管细胞，Myogenin表达增加的同时伴有MvoD表达下降，同时与快型肌肉相关的蛋白如肌浆网Ca2+-ATPase蛋白快型异型体、肌球蛋白重链Ⅱ表达受抑制[2]。

28d后肢悬垂后，与对照鼠的比目鱼肌相比，后肢悬垂鼠MHC-Ⅱa明显下降，MHC-Ⅱx增加，高敏感的RT-PCR方法测得后肢悬垂14 d后MyoD增加[13]。后肢悬垂引起慢肌向快肌转化的同时Myogenin表达不受影响。因此，作者认为MynD mRNA或Myogenin mRNA／MyoD mRNA可能在失重引起的肌肉萎缩及肌纤维的转换中起重要作用。

以上这些似乎暗示着MyoD、Myogenin mRNA或Myogenin／MyoD与肌肉表型间存在着因果关系。

本实验耐力训练条件下，Myogenin和MyoD mRNA均显著下降，同时，观察到MHC一Ⅱx mRNA显著下降(P

肌球蛋白重链组成影响肌肉收缩特性，因而有必要对于影响肌球蛋白重链表达的因素作一系统研究。本研究表明，耐力训练引起快型肌球蛋白重链基因表达减少。此外，本文欲从转录水平寻找可能调控MHCs表达的因素，因而，研究了MyoD、Myogenin这一对转录调节因子对于耐力训练的的反应，但由于样本数量的限制，没能得到MyoD或MvoD／Myogenin调控MHC一Ⅱx或MHC一Ⅱb表达的结论。虽然有研究显示，快肌中MyoD表达高，慢肌中Myogenin表达高，本人曾有同样的实验结果，但若想证实MyoD和(或)Myogenin参与MHCs转录的调节，本实验尚不能提供可靠的证据，还需要增加样本量，同时增加实验模型，来探讨MHCs转变的可能机制。[编辑：郑植友]