五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠VEGF、bFGF影响及形态学观察的实验研究

摘要：目的：观察单味五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠的影响，探讨五叶草莓抗肿瘤效果及可能机制。方法：对S180荷瘤小鼠实体瘤模型予以单味五叶草莓醇提物及CTX治疗，观察抑瘤率，胸腺、脾脏指数及肿瘤细胞中VEGF、bFGF的蛋白表达，并进行疗效分析。结果：CTX组及五叶草莓高、低剂量组的抑瘤率分别为51.69%、45.05%、37.77%，提示环磷酰胺的抑瘤率最高，五叶草莓有一定的抑瘤率；五叶草莓高剂量组与模型组比较脾脏指数明显升高，且具有显著差异（P

关键词：五叶草莓；肿瘤；VEGF；bFGF；实验研究

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0544-03

Influence of Alcohol Extract from Quinqueleaf Strawberry on VEGF

and Bfgf of S180 Tumor-Bearing Mice and Experience on Morphology

LI Qiao-lan，CHEN LI

(Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Xianyang 712046，Shanxi，China)

Abstract:Objective:The influence of alcohol extract from Quinqueleaf Strawberry on S180 tumor-bearing mice was observed and the effect as well as the mechanisms was analyzed. Methods:S180 tumor-bearing mice were treated with alcohol extract from Quinqueleaf Strawberry and CTX therapy. The tumor inhibition rate, the expressions of VEGF and bFGF in thymus, spleen and tumor cells were measured and analyzed. Results:The tumor inhibition rates of CTX group and high, low dose of Quinqueleaf Strawberry wee 51.69%,45.05%,37.77% respectively, indicating Cyclophosphamide has the highest tumor inhibition rate and Quinqueleaf Strawberry has some effects on tumor inhibition. Compared with the model group, the spleen index in high dose of Quinqueleaf Strawberry group was obviously increased, with significant difference（P

Key words:Quinqueleaf Strawberry; tumor; VEGF; bFGF; experiment research

收稿日期：2011-10-20

基金项目：陕西省教育厅资助项目［2008K16-06(1)］

作者简介：李巧兰(1956-),女,陕西汉中人,教授,硕士研究生导师，研究方向:中医老年病和心身疾病。五叶草莓(又名泡儿、栽秧泡，当地群众又称“白泡儿”、“地瓢儿”、“白草莓”),属蔷薇科草莓属多年生草本植物,是秦岭山区的一种野生植物，对生长环境要求不高，容易采摘，资源极为丰富，可食用或酿酒。当地民间草医常用其全草煎服治疗胃脘痛、腹腔肿块、小便不通、噎膈等病，每获良效。笔者根据民间应用经验,将五叶草莓全草粉碎装胶囊试用于消化道肿瘤(胃癌、食道癌、大肠癌、肝癌)及前列腺癌等疾病的治疗,对于缩小瘤体、缓解及改善全身症状,提高患者生活质量等方面有着极显著的效果。本课题拟通过对S180荷瘤小鼠VEGF、bFGF的检测分析，观察五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠肿瘤血管新生指标影响，试探讨五叶草莓抗肿瘤效果及可能的作用机制，为肿瘤的防治提供新的思路与途径。

1材料

1.1实验动物

选用健康雄性SPF昆明种小鼠50只，年龄4～9周，体重19～22g，由西安交通大学实验动物中心提供，合格证号：SGXK（陕）2007-001。

1.2瘤株

S180瘤株由第四军医大学实验动物中心提供。

1.3用药、试剂及仪器

1.3.1用药五叶草莓，采购自陕西秦岭山区，经陕西中医学院药学系生药教研室胡本祥教授鉴定为蔷薇科植物五叶草莓F. pentaphylla Lozinsk.的全草，本药为正品。用系统溶剂法对五叶草莓进行提取和粗分离，得浸膏,用生理盐水将浸膏稀释，高剂量组按生药量计算为8.26g・kg-1・d-1低剂量组按生药量计算为4.13g・kg-1・d-1，配好溶液备用。环磷酰胺注射液（CTX）(山西普德药业有限公司，批号：H14023686）

1.3.2试剂乙醇，兔抗VEGF免疫组化染色试剂盒、兔抗bFGF免疫组化染色试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色剂由博奥康医药公司提供。

1.3.3主要实验仪器GTK-2002自动恒温摊拷烘片机（西安瑞丰仪器设备有限公司），ZMN-7803自动组织包埋机（西安瑞丰仪器设备有限公司），LQ-A包埋蜡块修整仪（西安瑞丰仪器设备有限公司），YABO600电脑自动脱水机（常州市雅博电子设备有限公司），Motic显微镜及照相系统(Motic公司)，旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；电热恒温水浴箱（北京西城区医疗器械厂）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；电热鼓风干燥箱（北京科伟永鑫实验仪器设备厂）；电子天平（抚顺宇辰衡器有限公司），手术刀，止血钳，试管等。

2方法

2.1动物分组、模型制作及给药

所有小鼠先适应性喂养7天，后将在无菌条件下接种7天的荷瘤S180腹水瘤小鼠的腹水与PBS液按1∶3的比例进行稀释，离心后弃上清液，并用红细胞计数板计数瘤细胞 [(2～3)×107个/mL]，用台盼蓝溶液染色进行活细胞计数，若活细胞率＞95%后，在小鼠左腋皮下注射0. 2mL稀释液，制成实体瘤模型。参照《药理实验方法学》[1]将上述已接种S180腹水型肉瘤的昆明种鼠，于接种24h后随机分成4组，为空白组、模型组、CTX组、五叶草莓高、低2个剂量组共5组，各组体重无明显差异。模型组根据体重按0.2mL/10g用生理盐水灌胃1次，环磷酰胺（CTX）按0.04g/kg每天腹腔注射1次，高剂量组按生药量计算为8.26g・kg-1・d-1,用生理盐水将浸膏稀释，予0.4mL/只/日灌胃，低剂量组按生药量计算为4.13g・kg-1・d-1,用生理盐水将浸膏稀释，予0.4mL/只，灌胃，日1次。

毛色，精神，行动，进食水等一般情况观察。接种14天后小鼠脱臼处死，分别称取小鼠体重，解剖瘤体、脾、胸腺，分别称重，个别组出现提早死亡的动物则提前解剖称重纪录。计算抑瘤率、瘤/体比、脾/体比、胸腺指数和脾指数等[2]。抑瘤率=(C-T) /C×100% T为实验组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。胸腺指数=胸腺重/体重，脾脏指数=脾脏重/体重。

2.2血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)蛋白的测定

2.2.1标本提取接种14天后断颈脱臼处死荷瘤小鼠解剖瘤体，称重后置于4％多聚甲醛中固定24～48h，常规脱水，石蜡包埋，切片,留做免疫组化。

2.2.2VEGF bFGF免疫组织化学检测将组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯再浸泡10min，常规脱蜡，100％、95％、80％ 、70％酒精梯度水化，蒸馏水充分浸洗；3％H2O2室温下封闭30min以灭活内源性过氧化物酶，0.01M PBS(后同)洗10min，2次；滴加正常山羊血清封闭工作液，置湿盒中37℃孵育1h，甩去多余液体，勿洗；滴加适当稀释的VEGF抗体(工作浓度为1∶300)，置湿盒中37℃孵育1h，4 ℃过夜；复温至37℃ ，PBS洗10min，2次；滴加生物素标记山羊抗兔IgC，PBS洗10min，2次；DAB显色，70％、80％、95％、100％酒精依次梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。分别以抗体稀释液代替一抗作为阴性对照，在清晰的背景上出现特异性棕黄色颗粒者为阳性，在Motic显微镜下照相，应用计算机图像处理分析技术对免疫组化结果进行半定量分析，通过Motic Digilabii网络版数码显微镜互动教室进行彩色图文分析，测定免疫反应产物VEGF蛋白的平均光密度、积分光密度及平均灰度值，以备统计分析。

2.3病理组织学观察

随机取各组小鼠S180瘤块组织标本，经4%多聚甲醛固定24h，经常规脱水、透明、浸腊、包埋，切片HE染色，光镜下观察并拍照，并对各实验组肿瘤细胞种植部位侵袭程度进行组织学分级。

2.4统计学方法

各组数据用均数±标准差（±s）表示,应用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，组间比较采用多样本方差分析，两两比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

3结果

3.1各组小鼠抑瘤率对比

见表1。实验证明各组均有一定的抑瘤作用，以CTX组最为明显，抑瘤率达到51.69%；五叶草莓高、低剂量组抑瘤率分别为45.05%和37.77%（P

表1五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠的

抑瘤作用（±s）

组别n平均瘤重（g） 抑瘤率（%）CTX组100.84±0.10**51.69WYCM高剂量组100.95±0.30**45.05WYCM低剂量组101.08±0.31**37.77模型组101.73±0.47/注：与模型组比较差异显著，*P＜0.05；与模型组比较差异显著，**P＜0.01。

3.2各组小鼠胸腺指数及脾脏指数对比

见表2。胸腺指数：空白组与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）脾脏指数：五叶草莓高剂量组、空白组的与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）；CTX组与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）；五叶草莓高、低剂量组与CTX组比较，CTX、五叶草莓高剂量组、五叶草莓低剂量组与空白组比较，胸腺指数及脾脏指数均无明显差异（P>0.05）,但CTX组P值较小，说明中药五叶草莓对胸腺及脾脏有一定的保护作用，对免疫器官影响小于CTX。

表2五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠脾脏

指数与胸腺指数的影响（±s）

组别n胸腺指数脾脏指数CTX组101.36±0.36*4.82±0.89**WYCM高剂量组102.13±0.31 6.84±1.01WYCM低剂量组10 2.00±0.596.23±0.78模型组101.86±0.626.06±1.01空白组101.84±0.495.88±1.05注：*表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；**表示与模型组比较差异显著（P＜0.01）；表示与CTX组比较差异显著（P＜0.05）；表示与CTX组比较差异显著（P＜0.01）；表示与空白组比较差异显著（P＜0.05）。

3.3各组小鼠肿瘤细胞VEGF、bFGF表达水平的测定

灰度系指图像每一像素的明暗（深浅）程度，即该像素的图像由黑到白变化的量化等级。灰度值的大小与物质含量多少呈反比关系，灰度值越小，表示染色越深，所含物质的量越多。光密度又称吸光度，是指光线通过某一物质前与通过后光强度比值的对数值。光密度值与物质含量成正比关系，光密度值越小，说明光线被吸收的程度小，物质含量则越低[3]。

五叶草莓VEGF、bFGF蛋白在小鼠S180肉瘤组织中呈高表达，环磷酰胺及五叶草莓各剂量组可降低VEGF蛋白表达，其中VEGF与模型组相比有显著差异（P

表3五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠VEGF的影响（±s）

组别n阳性目标平均灰度阳性目标平均光密度阳性目标积分光密度CTX组10192.427±11.689**1.8×10-5±0.8×10-5**0.608±0.233**WYCM高10212.657±11.043**1.4×10-5±0.5×10-5**0.501±0.157**WYCM低10175.823±9.204*3.4×10-5±3.3×10-52.218±2.119模型组10164.023±9.5743.8×10-5±1.9×10-51.265±0.549注：*表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；**表示与模型组比较差异显著（P＜0.01）；表示与CTX组比较差异显著（P＜0.05）；表示与CTX组比较差异显著（P＜0.01）。

表4五叶草莓醇提物对S180荷瘤小鼠

bFGF的影响（±s）

组别n阳性目标平均灰度阳性目标平均光密度阳性目标积分光密度CTX组10179.121±20.20**3.4×10-5±2.6×10-50.863±0.287**WYCM高10169.041±17.385*3.7×10-5±2.0×10-51.067±0.376*WYCM低10150.354±34.0964.7×10-5±3.3×10-51.344±0.848模型组10137.581±32.6885.3×10-5±4.1×10-51.584±0.510注：*表示与模型组比较差异显著（P＜0.05）；**表示与模型组比较差异显著（P＜0.01）；表示与CTX组比较差异显著（P＜0.05）。

3.4肿瘤组织切片HE染色观察

肉瘤组织经HE染色，镜下观察（见插页Ⅲ图1），可见肿瘤细胞侵犯肌层，瘤组织呈片状生长，肿瘤细胞密集排列，细胞大小不同，形态各异；细胞核大小不一，核质比例增大；染色质呈颗粒状，分布不均匀，可见不对称性，多极性核分裂等病理性核分裂象，瘤体周围有广泛水肿、出血，大量新生血管形成。环磷酰胺组有大片的细胞坏死区，较多新生血管形成。五叶草莓高、低组均可见到不同程度的片状坏死区，瘤组织内及其周围微血管均减少。

4讨论

在实体瘤的生长、浸润和转移中，持续的血管生成是一个关键因素。新生的微血管是肿瘤浸润和转移的第一站，肿瘤微血管数量越多，肿瘤细胞进入血液循环的机会就越大，转移概率越大。死亡的几率也会大大增加。血管新生指在原有的毛细血管和/或微静脉基础上通过血管内皮细胞迁移、增殖、黏附和形成管腔样结构等,最终形成有功能的新血管的过程[4]。恶性肿瘤生长经历两个阶段:血管前期和血管期。在血管前期,恶性肿瘤主要通过弥散作用获取氧气及营养。当恶性肿瘤生长到2mm3之后即处于血管期,其生长绝对依赖于血管新生,肿瘤组织之所以生长迅速易于转移，是因为不断产生的大量新生血管提供了丰富的血液供应[5]。通过抑制血管新生,进而抑制恶性肿瘤的生长已经成为目前肿瘤学研究的热点[6]，并为筛选抗肿瘤药物和探求其抗癌机理开辟了新的途径、新的思路。在众多与血管形成相关的因子中，肿瘤细胞自分泌的血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)是两个最主要促血管生成因子，在肿瘤中的表达常被作为评估抗肿瘤血管生成剂的重要指标。此二者通过与特异受体结合促进血管内皮细胞增殖、迁移，最终形成新生血管[7]。本实验通过对这两个指标的检测，探讨五叶草莓抑瘤可能的作用机制。通过实验我们得知：CTX组及五叶草莓高、低剂量组的抑瘤率分别为51.69%、45.05%、37.77%，提示环磷酰胺的抑瘤率最高，五叶草莓有一定的抑瘤作用。中药五叶草莓对胸腺及脾脏有一定的保护作用，对免疫器官影响小于CTX。我们用免疫组化法对各组小鼠肿瘤组织进行VEGF、bFGF蛋白表达的检测，结果显示：五叶草莓VEGF、bFGF蛋白在小鼠S180肉瘤组织中呈高表达，环磷酰胺及五叶草莓各剂量组可降低VEGF蛋白表达，其中VEGF与模型组相比有显著差异（P

参考文献

［1］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：204.

[2]陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993.

[3]李和，周莉.组织化学与免疫组织化学［M］.北京:人民卫生出版社,2008：136-137.

[4]陈圆,杨博华.中药促进血管新生研究进展［J］.中国中西医结合外科杂志,2008,14(6):597-599.

[5]吴学元,马巍,任国文,等.肿瘤血管靶向治疗的研究进展［J］.现代肿瘤医学,2009,17(1):121-125.

[6]林菊丽,王彪,黄祖根,等.体外血管生成三维培养模型的构建［J］.2009,43(1):49-52.

[7]Twardowski P，Gradishar WJ.Clinical trial of antiangiogenie agents［J］. Curr Opin Oncol，1997,9(6):584-589.