选择性培养基对-20℃冷冻损伤沙门氏菌生长的影响

【中图分类号】R687.3 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2012)02－0319－01

【摘要】目的：分析常规检测中使用的氯化镁孔雀绿肉汤（MM）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB）对-20℃冷冻损伤沙门氏菌生长的抑制作用。方法：选用3株沙门氏菌作为研究菌株，-20℃冷冻贮存不同时间后，分析MM、SC、TTB对其生长的抑制作用。结果：1.MM、SC、TTB培养基可抑制-20℃冷冻损伤沙门氏菌的生长，MM、SC的抑制作用大于TBB的抑制作用；2.不同的菌株对冷冻的敏感性不同；3.在不同的冷冻时间，菌株的死亡率、损伤率不同。结论：常规检测中使用的MM、SC、TTB可抑制-20℃冷冻损伤沙门氏菌的生长。

【关键词】冷冻损伤；沙门氏菌；选择性培养基

A study of the inhibition of the select medium to the survival of the freeze-injured Salmonellae at -20℃

Zhangyong，Liu hengchuan，Yin qiangzhong，et al. 1.Center for disease control and prevention of Futian district Shenzhen city（Shenzhen 518040，china）；2.School of public health, Sichuan University（Chengdu 610041，china）.

【Abstract】Objective: To study the inhibition of the MM、SC and TTB to the survival of the freeze-injured Salmonellae at -20℃. Methods: The inhibition of the MM、SC and TTB to the survival of three freeze-injured Salmonellae at -20℃ storage was studied. Results:1.MM、SC and TTB inhibit the survival of the freeze-injured Salmonellae at -20℃，and MM and SC have more inhibition than TTB；2.Different types of Salmonellae have different sensitivities to freezing；3. Different types of Salmonellae have different proportion of freeze-injury and freeze-mortality during different frozen storage. Conclusions: MM、SC and TTB inhibit the survival of the freeze-injured Salmonellae.

【Key Words】freeze-injury ；Salmonellae；select medium

沙门氏菌是引起内地食物中毒的主要病原菌，也是污染食品的主要病原菌之一，其中以鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌引起的食物中毒食物中毒最为常见。有研究表明：鸭沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌在冷冻冷藏处理后，可遭受不同程度的亚致死性损伤，成为损伤菌。冷冻损伤菌对选择性培养基中的选择性物质，如：去氧胆酸钠等敏感，不能在含有这些选择性物质的培养基中生长，只能在非选择性培养基上生长。损伤菌在适宜的条件下，可进行修复，修复后的损伤菌，重新具有正常未损伤细菌的生理生化特性，恢复其对选择性物质的耐受性，可重新具有产毒、致病性［1］。因此，损伤菌的漏检，影响冷冻食品卫生状况的正确评估，可造成肠道传染病的爆发流行。

我国对于沙门氏菌的检测，常采用MM、SC 和 TTB进行选择性增菌，但对这些选择性培养基对冷冻损伤沙门氏菌生长的影响研究甚少。本研究立足于我国冷冻食品的常规检测，选用鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌作为研究菌株，分析常规检测中使用的MM、SC、TTB对-20℃冷冻沙门氏菌生长的抑制作用，现将结果报道如下：

1 材料及方法

1.1 菌株:选用3株沙门氏菌作为研究菌株：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、猪霍乱沙门氏菌ATCC50019、肠炎沙门氏菌CMCC47731，3株沙门氏菌菌株均购于中国药品检疫检验所。

1.2 培养基:非选择性培养基：TSYA（含0.3%酵母浸膏的胰胨大豆琼脂［2］），TSYB（含0.3%酵母浸膏的胰胨大豆肉汤TSB［2］）；选择性培养基：MM（氯化镁孔雀绿肉汤MM+1.5%琼脂粉）、SC（亚硒酸盐胱氨酸增菌液SC+1.5%琼脂粉）、TTA（四硫磺酸盐煌绿增菌液TTB+1.5%琼脂粉）。MM、SC、TTB均购于北京陆桥技术有限责任公司，按上述说明制成固体培养基，并在有效期内使用。

1.3 方法

1.3.1 制备菌悬液:将4℃保存的3株沙门氏菌试验菌株培养物接种于TSYB中，37℃培养16～18h，培养液3000r/min离心10min，弃上清液，加入NS（生理盐水）混悬并调节细菌浓度至106cfu/ml，分装于Eppendorf管中备用。

1.3.2 冷冻及解冻:将制备好的菌悬液在-20℃冷冻0、1、2、4、8、16、32、64、128天，25℃水浴解冻5min。

1.3.3 菌落计数:将已解冻的菌悬液立即用NS作10倍系列稀释，选取适当稀释倍数的菌液，吸取0.5ml，分别涂布于非选择性平板TSYA和3种选择性平板上，37℃或42℃培养24～48h，菌落计数。TSYA平板上的菌落数为冷冻后损伤和未损伤的菌落数，选择性平板上的菌落数为冷冻后未损伤的菌落数。

1.4 数据分析:采用spss10.0统计分析软件，菌株间损伤率、死亡率的差别用配伍组设计的方差分析进行分析，选择损伤率大的菌株绘制生长曲线图。

1.4.1 计算公式:损伤率(%)=(冷冻后TSYA上菌落数×稀释倍数-冷冻后选择性平板上菌落数×稀释倍数)/(冷冻后TSYA上菌落数×稀释倍数)×100死亡率(%)=(冷冻前TSYA上菌落数×稀释倍数-冷冻后TSYA上菌落数×稀释倍数)/(冷冻前TSYA上菌落数×稀释倍数)×100

1.4.2 生长曲线图:以冷冻时间为横坐标，lg（冷冻后TSYA上菌落数/ml×稀释倍数）、lg（冷冻后选择性平板上菌落数/ml×稀释倍数）为纵坐标作图，分析冷冻损伤敏感菌株在选择性、非选择性培养基上的生长情况。

2 结果

2.1 冷冻损伤的分析：见表1～表4

表1～表4结果表明：①.-20℃冷冻保存可造成鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的大量冷冻损伤，不同时间的损伤率不同，随着冷冻时间的延长，损伤率呈上升趋势；②.TTB、SC、MM均可不同程度地抑制-20℃冷冻损伤沙门氏菌的生长，平均损伤率分别从49.76%、66.01%、75.29%上升至约100.00%以上，抑制作用的大小顺序为：TTBa

2.2 死亡率的比较：见表5

结果表明：①. -20℃冷冻保存可造成的鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的大量冷冻死亡，随着冷冻时间的延长，死亡率呈上升趋势；②.不同菌株的死亡率不同，其大小顺序为：肠炎沙门氏菌a

2.3 肠炎沙门氏菌CMCC47731在TSYA、MM、SC、TTA平板上生长情况：见图1

从图1可知：随着冷冻时间的延长，肠炎沙门氏菌在TSYA、MM、SC、TTA平板上的菌落数呈下降趋势，MM、SC、TTA培养基上的菌落数下降速度远远大于TSYA培养基上的菌落数下降速度，提示：-20℃冷冻保存可造成肠炎沙门氏菌的冷冻损伤，MM、SC、TTB培养基可抑制-20℃冷冻损伤肠炎沙门氏菌的生长。

3 讨论

3.1 选择性培养基对冷冻损伤菌生长的抑制作用:在选择性增菌过程中使用的选择性培养基，其中含有的各种选择性成分，在其使用浓度范围，并不明显抑制正常未损伤菌的生长［3］，选择性培养基是否抑制冷冻损伤菌的生长及其抑制作用的大小，与所含有的选择性物质的种类、浓度有关。0.25%去氧胆酸钠，可抑制40%～90%冷冻损伤鸭沙门氏菌生长［4］，胆盐可抑制-20℃冷冻损伤大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、产气克雷伯氏菌的生长［5］，但对于其它选择性物质抑制冷冻损伤沙门氏菌生长的作用少见报道。SC、MM、TTB培养基中分别含有的连多硫酸钠、孔雀绿、胆盐和煌绿可能与上述培养基对冷冻损伤沙门氏菌生长的抑制作用，也提示连多硫酸钠、孔雀绿对冷冻损伤菌具有更大的抑制作用，但每种选择性物质抑制作用的大小、选择性物质间是否有联合作用、联合作用的大小与方式、则有待进一步研究与分析。

3.2 菌株间冷冻敏感性的比较:研究结果显示：不同的菌株，对冷冻损伤的敏感性不同。文献中也有类似的报道，如：Hara等［6］在研究5株EHEC O157H7对冷冻损伤的敏感性时发现，970056与ATCC43890的冷冻损伤敏感性高于212、ATCC43889、ATCC43894。冷冻处理后的细菌以三种存在形式：正常未损伤菌、损伤菌、死亡菌。如果细菌对于冷冻的敏感性过高，则主要以死亡的形式存在，可表现为死亡率大，而损伤率相对较小；如果细菌对于冷冻的敏感性过低，则主要以正常未损伤的形式存在，可表现为死亡率、损伤率都较小；如果细菌对于冷冻的敏感性达到一定的程度时，则主要以损伤的形式存在，表现为损伤率大，而死亡率相对较小。由于细菌的损伤在适宜的条件下可以修复，以损伤形式存在的细菌最具有卫生学意义。

综上所述，冷冻保存可造成沙门氏菌的大量冷冻损伤，不同的菌株，其损伤程度不同。因此，在日常工作中，对于送检的非冷冻样品尽量不要冷冻保存，要尽快检验。对于冷冻食品中沙门氏菌的检测，要充分考虑损伤菌的存在，在使用选择性培养基以前，在非选择性培养基中前增菌一段时间，以修复冷冻损伤菌，提高检出率，真实反映食品的卫生状况，以保证食品安全。

参考文献

［1］ 孟昭赫主编.食品卫生检验方法注解 微生物学部分［M］.北京：人民卫生出版社,1990：860-870。

［2］ M.L.斯佩克主编.食品微生物学检验方法摘要［M］.北京：人民卫生出版社, 1982:112-119。

［3］ 张宽厚主编.细菌生理学［M］.北京：人民卫生出版社，1961:59-67。

［4］ Janssen DW,Busta FF.Influence of milk components on the injury, repair of injury and death of Salmonella anatum cells subjected to freezing and thawing［J］.Appl.Microbiol.1973, 26(5):725-732.

［5］ 张勇，刘衡川，周海涛，等. 冷冻损伤大肠菌群在乳糖胆盐发酵培养基上生长状况［J］.中国热带医学，2009，9（6）：999-1001。

［6］ Hara-Kudo Y,Ikedo M,Kodaka H.et al.Selective enrichment with a resuscitation step for isolation of freeze-injured Escherichia coli O157:H7 from foods［J］.Appl.Environ.Microbiol.2000,66(7):2866-28729.

作者单位 518040 深圳市福田区疾病预防控制中心1

610041 四川大学华西公共卫生学院 2