利用玉米和鸭茅状摩擦禾诱导小麦单倍体和双单倍体的研究进展

摘要：小麦（Triticum aestivum L.）远缘杂交诱导单倍体技术能有效提高育种效率，缩短育种年限，创造新种质和遗传群体。20多年来的研究利用趋势表明，玉米（Zea mays L.）染色体消失产生小麦单倍体是应用最广泛的方法，鸭茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.）染色体消失产生小麦单倍体也有应用的潜力，但是都未做详细的对比研究，至今尚未成为小麦育种的成熟技术手段，主要原因是在小麦单倍体胚的诱导、萌发以及染色体加倍等方面仍存在许多问题，目前还达不到稳定、高频率生产小麦单倍体和双单倍体的技术水平，导致与育种结合推广应用的速度很慢。

关键词：小麦（Triticum aestivum L.）；玉米（Zea mays L.）；鸭茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.）；远缘杂交；染色体消失；单倍体胚；双单倍体

中图分类号：S512.1；S513；S334.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）01-0008-05

Advances on Producing wheat Haploid and Doubled Haploid from Crosses of

Wheat×Maize and Wheat×Eastern Gamagrass

ZHAO Cui-rong，YU Hua-qiang

（Xiangyang Academy of Agricultural Science in Hubei Province， Xiangyang 441057， Hubei， China）

Abstract： The technology of producing wheat（Triticum aestivum L.） haploid by wheat distant hybridization can improve breeding efficiency， shorten breeding period and create new germplasm and genetic population. Research results during last 20 years suggested that producing haploid wheat by eliminating maize（Zea mays L.） chromosome was the widely used method，and eliminating eastern gamagrass（Tripsacum dactyloides L.） chromosome was the most potential way. But there is no detailed comparative studies of the two methods. There are problems in the process of wheat haploid embryo production， germination and the chromosome doubling. At present the two methods are still not so popular because of its low efficiency and unstability in producing wheat haploid and doubled haploid.

Key words： wheat（Triticum aestivum L.）； maize（Zea mays L.）； eastern gamagrass（Tripsacum dactyloides L.）； wide cross； elimination of chromosome； haploid embryo； doubled haploid

收稿日期：2012-12-19

基金项目：国家小麦产业技术体系建设项目（CARS-03-01A）；湖北省农业科技创新中心资助项目；湖北省小麦工程技术研究中心建设项目

作者简介：赵翠荣（1975-），女，湖北随州人，副研究员，在读硕士研究生，主要从事小麦生物技术育种研究，（电话）0710-3085380（电子信箱）

。

国外20世纪70年代就有利用远缘杂交导致父本染色体消失从而诱导小麦（Triticum aestivum L.）单倍体的相关研究报道，20世纪80年代中后期以英国、法国、加拿大为代表的学者在利用玉米（Zea mays L.）诱导小麦单倍体领域的研究发展较快。多年来，应用此项技术在法国、加拿大等国已经育成一批高产优质小麦品种，目前已经推广应用到欧洲和中东主要小麦产区；同时发展了一整套规模化的成熟单倍体育种技术体系，每年培育单倍体苗达到数以万计的规模。

在国内，中国科学院和中国农业科学院从20世纪90年代初开始开展了利用玉米或鸭茅状摩擦禾（Tripsacum dactyloides L.）花粉诱导小麦产生单倍体的基础研究，取得了一些有意义的研究结果，但是都未做详细的对比研究，至今尚未成为小麦育种的成熟技术手段，直到2011年3月才首次出现了应用此项技术育成小麦品种的报道[1]。究其原因，一是国内缺乏规模化的诱导单倍体育种的成熟技术流程和规范，二是缺乏较长季节进行远缘杂交的条件和经验，在单倍体胚的产生频率和幼胚萌发方面效率太低，不能达到育种所需要的群体规模。

1 技术起源

随着科学的发展，小麦族（Triticeae）远缘杂交在分类学上的界限日益被打破，过去认为不可能杂交的种、属，现在杂交获得了成功。自1971年Lange[2]报道了利用栽培大麦（Hordeum vulgare L.，2n=2x=14）和球茎大麦（Hordeum bulbosum L.，2n=2x=14， 2n=4x=28）远缘杂交后父本的染色体消失可以产生大麦单倍体之后，1975年Barelay[3]首先报道了用普通小麦（2n=6x=42）和球茎大麦杂交后，父本染色体迅速消失，可以获得小麦单倍体胚，但因小麦可性抑制基因Kr的限制导致了此法对小麦基因型具有选择性，从而限制了此法的育种应用。

1984年德国学者Zenkteler等[4]报道指出，禾本科早熟禾亚科（Pooideae）的普通小麦与黍亚科（Panicoideae）的玉米（2n=2x=20）远缘杂交可产生球形幼胚，但没有细胞学证据，很多学者对这些持有怀疑态度。1986年英国学者Laurie等[5]发表了普通小麦与玉米远缘杂交可发生受精作用的细胞学证据，证明小麦与玉米杂交后，在最初的3次细胞分裂中，来自玉米花粉的染色体被逐渐完全排除掉，仅剩下21条母本小麦染色体的单倍体。进一步利用小麦品种间代换系进行试验，发现小麦×玉米的受精频率不受Kr基因的影响[6，7]，即Kr基因在小麦×玉米中是不敏感的，为后来玉米法诱导小麦单倍体的育种应用奠定了理论基础。

有学者先后发表了普通小麦与玉米[4，5]（2n=2x=20）、高粱（Sorghum bicolor，2n=20）[8]、珍珠粟（Pannisetum americanum，2n=14）[9]、类玉米（即大刍草，Zea mays ssp. Mexicana，2n=20）[10]、鸭茅状摩擦禾（2n=4x=72）[11，12]杂交产生小麦单倍体的研究报告。这些杂交打破了以往小麦只能与一些小麦族族内属，如黑麦属（Secale）、山羊草属（Aegilops）、偃麦草属（Elytrigia）、披碱草属（Elymus）、大麦属（Hordcum）及簇毛麦属（Hynaldia）杂交的局限[13]，使分类距离相当远的属间杂交成为可能，这些研究强有力地推动了远缘杂交理论和利用父本染色体消失产生单倍体技术研究的发展，并成为远缘杂交染色体消失法诱导小麦单倍体育种的最早记载。

2 研究进展

近年来，国、内外许多学者对利用远缘杂交父本染色体消失产生单倍体的方法进行了广泛的研究，并取得了较大进展，在利用玉米和鸭茅状摩擦禾诱导小麦单倍体方面进展也很快。

2.1 染色体消失法的细胞学、生物化学、分子生物学研究

Comeau等[14]用一种新设计的培养基培养小麦与玉米杂交后0～4 d的胚珠，然后再从中剥幼胚拯救，所获得的小麦单倍体中有1株的根尖中除21条小麦染色体外还含有l条玉米染色体，但是在加倍的后代中丢失了。1991年王景林等[15]、1992年孙敬三等[12]、1993年陈纲等[16]、陈新民等[17]分别报道了利用普通小麦与玉米杂交产生小麦单倍体胚和苗，之后国内一些单位也进行了小麦与玉米杂交产生双单倍体（Double haploid，DH）的技术研究，先后发表了普通小麦与玉米杂交产生小麦单倍体的阶段性研究成果。1996年刘辉等[18]在小麦×玉米所获得的DH后代蛋白质电泳分析中，发现14.4%的DH株系出现玉米所特有的谱带。1997年陈纯贤等[19]用玉米特异的重复DNA序列为探针对来自小麦×玉米的2个小麦DH群体进行RFLP分析，首次发现和证实了异源玉米特异DN段的确在染色体消除过程中能以很低的频率导入到小麦的DH后代中。2011年陈新民等[1]首次用玉米与小麦进行远缘杂交，并育成优质抗病小麦新品种中麦533。

1994年李大玮等[20，21]最早报道了普通小麦与玉米族（Maydeae）摩擦禾属（Tripsacum）的鸭茅状摩擦禾杂交成功，并获得了较普通小麦与玉米杂交更高的单倍体胚成胚率（2～3倍）。1999年邱纪文等[22]报道了在小麦×鸭茅状摩擦禾杂交后代的分子检测中发现鸭茅状摩擦禾DN段导入小麦基因组的证据。2000年李大玮等[23]报道了普通小麦与鸭茅状摩擦禾杂交可获得比小麦与玉米杂交更高的受精率和成胚率，且杂交亲和性不受小麦可性抑制基因Kr的控制[24]，提出小麦与鸭茅状摩擦禾比小麦与玉米杂交更具优越性的观点。

2.2 染色体消失法的开发利用研究

1988年Laurie等[25]提出了小麦与玉米杂交时，在玉米染色体消失前对杂合子进行辐射处理，以期使玉米基因导入小麦的设想，对于小麦种质资源的创新、品种改良和遗传研究等方面都具有重要意义。1996年欧阳平等[13]提出：小麦与鸭茅状摩擦禾杂交后，鸭茅状摩擦禾的染色体在杂合子发育初期并未完全消失，而是以不同程度保留下来，不全是小麦单倍体，大部分为具有21～56条染色体数不等的非整倍体杂种，这对外源染色体或染色体片段向小麦导入是非常有利的；若鸭茅状摩擦禾的染色体或染色体片段能够通过与小麦染色体易位、交换或代换的方式导入小麦，将会打破小麦族内杂交的局限性，加速小麦种质材料的创新，为丰富小麦的遗传背景做出贡献。因为鸭茅状摩擦禾除具有一般野生型植物生长势强、抗病、抗虫、耐旱、耐寒、耐瘠薄等特性[20，21，26]外，还具有C4类型植物高光效及其独有的兼性无融合生殖特性，对小麦杂种优势利用方面具有积极意义。

2.3 诱导小麦单倍体的成效对比研究

李大玮等[20，21，23]提出鸭茅状摩擦禾为野生型、多年生，在很多北方地区可户外越冬，有助于克服小麦×玉米中每年在温室播种玉米难以控制花期的困难，它穗多且大，花期长，花粉多，可较长时间提供大量花粉，鸭茅状摩擦禾诱导得胚率是玉米诱导的2～3倍，但存在较多的非整倍体，从外源基因导入的角度认为小麦×鸭茅状摩擦禾比小麦×玉米更具优越性；而2003年范金萍等[27]的研究表明玉米作为花粉供体植物是当时产生小麦单倍体最成功的方法。

2.4 主要技术环节

比较几十年来公开发表的关于该项技术的学术论文和研究报道发现，其技术环节的研究内容主要包括：双亲花期相遇的调节技术，小麦基因型对得胚率的影响，不同基因型玉米与摩擦禾对小麦得胚率的影响，不同杂交技术对得胚率的影响，不同激素种类、不同激素处理浓度配比对得胚率的影响，不同培养基对胚萌发的影响，不同加倍处理方法对加倍效果的影响，单倍体与双单倍体的区别与鉴别方法。

2.4.1 双亲花期调节技术 双亲花期调节技术的研制成功是诱导小麦产生单倍体的必要和首要条件。除胡冬梅[28]、蔡华等[29]、顾坚等[30]的试验有提及外，此项技术关于花期调节方面鲜有报道。

2.4.2 影响成胚因素方面的研究 从授粉到单倍体胚的形成和发育，影响因素很多，综合来看主要包括：不同玉米与鸭茅状摩擦禾基因型，不同国家、不同地域、不同生态习性、不同组合的不同小麦基因型（太谷核不育基因、Kr基因的影响也有研究），授粉或激素处理的时机、浓度与方法，环境温度、湿度、光照等。

2.4.3 胚萌发的影响因素 诱导形成的单倍体胚在植株生长到一定的时期后取回室内进行消毒处理和无菌接种，在人为创造的营养条件和光照、温度、湿度条件下无菌生长萌发成苗。其萌发比例受很多因素的影响，如培养基成分、光照时间、光照度、光质、温度与变温处理、湿度控制等。

2.4.4 单倍体植株的移栽 室内胚无菌萌发成苗后长到2～3叶时可以移栽。要保证移栽成活，培育壮苗是关键，同时保证逐步过渡和适应外部条件也是关键。

顾坚等[30]的试验结果表明，单倍体胚培养的幼苗在昆明市不需越夏，5月中旬至6月中旬杂交获得的单倍体苗移栽加倍后一般可于当年9～11月收获加倍单倍体种子。范金萍等[27]在冬季把试管苗移栽至不加温的温室中，保持较高的湿度，取得了94.3%的移栽成活率和95.7%的加倍率。周传恩等[31]认为移植根系不发达的再生植株可以加0.5 μmol/L萘乙酸（NAA）促进根系生长。王成社等[32]指出，在壮苗培养基中添加一定浓度的多效唑（MET）可提高小麦花培试管绿苗的移栽成活率。秦静远等[33]、白延红[34]报道，在16 ℃低温条件下，在壮苗培养基中添加2～3 mg/L的MET不仅可以使花粉植株生长健壮，安全越夏，而且可以大幅度提高移栽成活率。来长凯[35]认为小麦单倍体幼苗移栽（从培养基中移栽到土壤中）应遵循逐渐过渡的原则。

2.4.5 单倍体植株加倍 单倍体植株的成功加倍是育种应用的前提。

1）试剂的选择。到目前为止，秋水仙素仍然是诱导植物体细胞染色体加倍的最有效的化学诱变剂之一。秋水仙素是微管特异性药物，由于适宜浓度的秋水仙素能破坏或抑制纺锤丝的形成，可使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍[36]。二甲基亚砜（DMSO）能够提高植物组织的渗透性，使药物容易进入植物细胞[37]。纪凤高等[38]、Wang等[39]在诱导小麦多倍体时，发现DMSO不仅能促进秋水仙素快速浸透到植物组织中，并能显著提高秋水仙素的加倍效果。

2）试剂浓度与加倍方法。加倍方法可采用浸根、直接加入培养基中、注射分蘖节等方法，通常采用秋水仙素浸根处理。国外常用高浓度（1 000 mg/L）、高温度（20～25 ℃）、短时间（5 h）处理，而国内常采用低浓度（400～500 mg/L）、低温度（10～15 ℃）、长时间（1～3 d）处理。

3） 加倍后的移栽环境控制。傅杰等[40]、王培等[41]对花粉植株的染色体加倍采用覆盖塑料薄膜保湿和适时加倍等简单措施取得了很好的移栽和加倍效果。范金萍等[27]认为加倍后移栽保持较高的湿度有利于成活。

2.4.6 倍性检测方法研究 植株倍性检测的方法很多，有直接形态学鉴定、花药育性形态学观察、结实率统计、气孔保卫细胞长度检测、根尖染色体数压片检测、同工酶分析等多种方法[42]。最简单直观的鉴定方法是看是否结实，因为未加倍成功的单倍体植株是不结实的。秦余香等[43]指出鉴定花粉植株倍性通常采用压片法观察染色体。但是这种方法程序繁琐且工作量大。用气孔保卫细胞长度来鉴定花粉植株倍性的方法简便快速，试验结果稳定可靠。杜丽璞等[44]的试验表明，气孔保卫细胞长度受染色体倍性控制；单倍体与二倍体之间气孔保卫细胞长度差异非常显著，单倍体气孔保卫细胞长度一般在60 μm以下，二倍体气孔保卫细胞长度一般在70 μm以上。有研究认为，由于气孔保卫细胞长度受测试叶片取样部位的影响，所以从同一部位取样为宜，这样可以减少取样误差，提高准确性[45]。另外，利用流式细胞仪测定也是一种快速检测染色体倍性的方法。

3 存在的问题

小麦远缘杂交诱导单倍体技术能有效提高育种效率，缩短育种年限。国内20多年来的研究利用趋势表明，玉米染色体消失产生小麦单倍体是最有效的方法，鸭茅状摩擦禾染色体消失产生小麦单倍体也有应用的潜力，但玉米在染色体消失法诱导小麦单倍体过程中的应用远远超过了鸭茅状摩擦禾的应用，笔者分析认为，小麦和鸭茅状摩擦禾杂交产生了较多的非整倍体，可能是鸭茅状摩擦禾在诱导单倍体方面的限制因素。

自20世纪90年代初我国开展染色体消除法诱导小麦单倍体技术研究以来，许多研究者对利用玉米或鸭茅状摩擦禾诱导小麦产生单倍体这两种获得小麦单倍体的方法进行了深入的研究，进展很快，但在小麦单倍体胚的诱导、单倍体胚的萌发以及染色体的加倍等方面仍存在许多问题，目前还达不到稳定、高频率生产小麦单倍体和双单倍体的技术水平，导致与育种结合推广应用的速度很慢。其原因一是远缘杂交后染色体消除法诱导小麦单倍体技术是一个多步骤、多方法、多因素影响的综合性强、协调性要求严格的系统工程，中间环节很多。从花期调节到整穗授粉、激素处理、胚抢救、胚培养、单倍体苗越夏、移栽、染色体加倍、倍性检测等诸多环节，既需有田间育种试验经验又需有室内无菌培养条件和技术，还涉及到温室与大棚中玉米的栽培、细胞学方面的一些综合知识和实际技能，需要一定的经验积累才能建立起全套技术规范。二是影响最终DH系获得频率的因素很多，综合来看染色体消除法诱导小麦单倍体的得胚率普遍较低，尚没有形成稳定的得胚率和育种所需的DH群体规模。因此在确保适宜小麦开花结实期有充足的父本花粉源的前提下，应从提高得胚率、绿苗分化率、移栽成活率、染色体加倍率等诸多方面共同促成高效育种体系的建立。

致谢：感谢李宏潮研究员、陈新民研究员对本研究的悉心指导。

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