利用Gn1a基因进行粳稻穗粒数改良的研究

摘要：增加穗粒数是提高水稻产量的有效途径，为了培育高产中熟粳稻新品系，采用回交育种并结合分子标记辅助选择技术，将感温型大穗品系HK05418的大穗基因Gn1a导入到感光型优质晚粳品种秀水134中。在BC2F4代得到农艺性状稳定、等位基因纯合、早熟且每穗粒数、单株产量显著优于秀水134的稳定株系C3068。

关键词：粳稻；Gn1a基因；分子标记辅助选择；穗粒数

中图分类号：S330 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）21-5455-03

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.21.005

Study on Improving Grain Number of Japonica Rice by Using Gn1a Gene

YIN De-suo，LI Jin-bo，WAN Bin-liang，FANG Guo-cheng，QI Hua-xiong

（Food Crop Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China）

Abstract： Increasing grain number is a reliable way to abstain high yield of rice. In order to develop new japonic lines possessing high yield potential，the Gn1a MAS（molecular assistant selection） assay was carried out，the null allele of Gn1a in HK05418 was transferred to the target variety，Xiushui 134. By backcrossing，inbreeding，screening and selecting，a new line C3068 from BC2F4 was identified as more early maturing and high yield than the control variety Xiushui 134.

Key words： japonica rice； Gn1a gene； molecular assistant selection； grain number

水稻（Oryza sativa L.）高产一直是育种者追求的目标。水稻的单位面积产量由单位面积内的有效穗（分蘖数）、穗粒数、结实率及粒重（粒型）共同组成。与水稻分蘖能力和粒重、粒型相关的主效基因近年不断被报道，例如控制粒型和粒重的GS3[1]、GW2[2]、GW5[3]、GW8[4]、GW7[5]等，控制分蘖数的MOC1[6]，控制穗粒数的Ghd7[7]和Gn1a[8]等。这些主效基因的鉴定和克隆，使得利用分子标记辅助选择来进行水稻产量性状的改良成为了可能。

近年来，随着人们生活水平的提高，由于品质和口感较好，粳稻发展较快，种植区域已经从东北向华东、华中、华南地区延伸[9]。湖北省在继江苏、安徽等省进行“籼改粳”后，也开始了水稻的产业结构调整。20世纪70年代，湖北粳稻由于a量潜力较低而逐渐被杂交籼稻取代，鉴于此，要扩大湖北省粳稻种植面积，需要培育适应湖北省稻区光温条件、产量潜力更高的新品种。

Gn1a基因编码细胞分裂素氧化酶，可以降低幼穗原基中分裂素的表达水平，从而减少穗部颖花数量，而Gn1a基因功能缺失的单倍型会导致穗粒数增多[8]。本研究针对粳稻的产量性状，利用设计的Gn1a基因分子标记，筛选Gn1a基因功能缺失的粳稻种质资源，采用杂交育种并结合分子标记选择的方法，将目的基因导入受体品种，对优良品种进行穗粒数改良，旨在提高产量潜力，培育粳型中稻新品系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

HK05418为湖北省农业科学院育成的感温型大穗粳稻品系，作为大穗型Gn1a基因供体亲本；秀水113、秀水134为浙江省嘉兴市农业科学院育成的优质感光型晚粳品种，对稻瘟病抗性较好，分蘖较多，中小型穗型；秀水519为嘉兴市农业科学院育成的早熟优质粳稻品种，作为生产对照材料；上海粳1号和上海粳2号为上海市农业科学院育成的优质晚粳品系，用作引物筛选。

1.2 引物设计

根据Ashikari等[8]报道的Gn1a基因编码区的突变位点，在缺失突变区的两端设计PCR扩增引物，经过引物筛选，选择分辨率较高的扩增引物作为该性状的候选分子标记。

1.3 基因检测方法

采用改良的CTAB法[10]提取水稻叶片总DNA。引物序列由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应在PE公司9700型热循环仪上进行，扩增反应物的总体积为15 μL，其中包括1×PCR缓冲液，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上下游引物各为50 pmol，水稻基因组DNA 1.5 ng/μL，Taq酶1 U（TaKaRa公司产品）。反应程序为：95 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物于6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶上分离，银染操作参照李进波等[11]的改良方法。

1.4 产量性状调查

考察单株穗数、每穗粒数和实粒数，并统计结实率。统计小区的播始历期和单株的实收产量。

1.5 米质分析

主要统计糙米的垩白粒率和垩白度，观察比较米粒的透明度和油分、光泽等品质性状。

2 结果与分析

2.1 Gn1a基因分子标记在亲本材料中的多态性

用primer 3.0的在线引物设计程序，根据目标基因编码区内的缺失突变位点，设计了PCR扩增引物（Gn1aF：5′gctatctatcagctgccttc3′，Gn1aR：5′cctgctctt gcttcattatc3′）。用所设计的引物在大穗品系HK05418和小穗型品种秀水113、秀水134、上海粳1号、上海粳2号等品种间进行多态性验证，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶5 V/cm电压分离，不含Gn1a基因的小穗型品种扩增出了较大的产物条带（日本晴参考序列为167 bp，图1），而大穗品系HK05418扩增出较小的PCR产物条带（图2）。

2.2 分离群体的标记检测

将秀水134/HK05418组合F2分离世代的单株表型和基因型进行对比验证，结果表明，含大穗基因型（Gn1a）单株的平均穗粒数为187.8～205.6粒，明显多于小穗基因型（gn1a）单株的129.2～162.8粒，即基因型与表型共分离，证明Gn1a基因确实是该分离群体中控制穗粒数的主效基因（图3）。

2.3 大穗材料的培育

2009年夏季在武汉配制秀水134/HK05418的F1组合，2010年春在海南、2010年夏在武汉连续用秀水134作为母本进行回交，得到BC2F1，然后连续自交。在上述回交和自交世代采用标记辅助选择，选择含大穗Gn1a基因型的单株进行回交和自交，于2012年夏得到目标基因纯合、农艺性状稳定的BC2F4家系。

在自交世代，除了进行大穗性状选择，同时进行生育期的选择。由于秀水134是晚粳品种，发育特征表现为较强的感光性，而HK05418为感温性品种，两者杂交后代出现了感温性和感光性的分离，携带发育感温基因的单株在海南生育期较长，而在武汉则较短；携带感光发育基因的单株则相反。针对熟期进行单株选择的策略是在海南选择长熟期（感温型）单株，在武汉选择短熟期单株，以此方法淘汰掉含有发育感光基因型的单株。再经自交稳定后，育成适合湖北省稻区的大穗、早熟、矮秆的粳型中稻新品系C3068（图4）。

2.4 综合农艺性状评价

与亲本对照相比，育成的大穗新品系株高较低，熟期较早，穗粒数较多（图5，表1），达到了品种改良的主要目的。新品系外观品质明显优于HK05418，接近秀水134（图6）。

经过2013-2014年武汉和仙桃两地品种比较试验表明，新品系丰产性较好，结实率与对照品种相比略低，但每穗实粒数和单株实粒数明显高于对照（表1）。

2.5 稻瘟病抗性鉴定

2013年将大穗粳稻新品系在宜昌和恩施病区进行稻瘟病抗性鉴定，结果表明，新品系的叶瘟和穗瘟抗性达到抗和中抗水平，与对照水平相当（表2）。

3 讨论

本研究采用自行设计的Gn1a基因的分子标记，对优质晚粳品种秀水134进行穗粒数改良，同时对熟期和抗性进行了筛选，得到了大穗、早熟、矮秆、抗稻瘟病的优质粳型中稻新品系。研究结果表明，通过Gn1a基因的分子标记辅助选择进行穗粒数改良是有效的。

水稻产量一般由单位面积内穗数、平均穗粒数、结实率和千粒重等因子决定，而这些产量决定因子都是由数量性状基因控制的，传统的育种方法很难进行有效的后代选择，必须借助于可靠的标记选择。同时，各个因子间也会存在复杂的互作和协同变化现象，例如，穗粒数增加可能会导致结实率下降；生育期缩短会导致分蘖数和穗粒数的下降。因此，在利用分子标记进行目标性状的选择时，兼顾其他相关性状的变化及选择仍然非常重要。同时保证一定规模的选择群体也是必要的，这样为打破不利连锁提供了可能。

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