蝗虫抗菌性的抗菌效果刍议

纯化抗菌活性物质对细菌的抑菌效应分别比较抗菌活性物质对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及水稻白叶枯病原菌的抑菌活性，采用国际通用抗生素效价测定方法即杯碟法，测定抑菌圈直径，每种菌种3次平行。将菌种接种于LB液体培养基中在恒温摇床中37℃培养6h，然后将培养液稀释成106个／mL的菌液。取500μL的菌液涂布于LB固体培养基制成平板中，放上4个牛津杯，分别加上200μL的样品液，200μL的蒸馏水作为阴性对照，最后一个则不加任何物质作为空白对照。然后在37℃恒温培养箱中培养过夜，第二天观察记录抑菌效果。1．2．5抗菌活性物质浓度测定依照紫外吸收法［7］取纯化后的抗菌活性物质溶液50μL，用蒸馏水稀释，分别在280nm、260nm处测定吸收值，按下式计算蛋白浓度（mg／mL）。c＝（1．45A280－0．74A260）×稀释倍数式中：c为抗菌活性物质原始浓度（mg／mL）；A280为蛋白溶液在280nm处测得的吸光度；A260为蛋白溶液在260nm处测得的吸光度。1．2．6抗菌活性物质收率测定东亚飞蝗抗菌活性物质收率测定用邹锋采用的方法［8］。蝗虫抗菌活性物质收率＝c•V／m×100％式中：c为抗菌活性物质滤液浓度（mg／mL）；V为滤液体积（mL）；m为蝗虫质量（g）。

结果

抗菌活性物质粗提物的萃取三组刺激后的东亚飞蝗与未经诱导的一组东亚飞蝗，每组10只，去除腿与翅膀后，经过组织匀浆，每组各得到16mL左右的匀浆液，经处理纯化后得到粗提物13mL，各组取3mL做抑菌试验。粗提物抗菌活性的筛选本试验中，无刺激以及刺激后饲养24h、48h和72h不同处理条件下的东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液均有一定的抑菌活性（图1）。图1结果显示，未刺激与刺激后饲养72h的两组东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液抑菌活性效果不明显；针刺腹部，浸泡大肠杆菌后饲养48h的东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液抑菌活性明显高于对照和刺激后饲养72h的抗菌活性物质粗提液；针刺腹部，浸泡大肠杆菌后饲养24h的东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液抑菌活性在四组中最高。2．4抗菌谱的测定东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）或对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、水稻白叶枯病原菌）均有一定的抑制作用，其抗菌谱为：金黄色葡萄球＞水稻白叶枯病原菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌（见图3），其中以对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最明显（见图4）2．5抗菌活性物质的浓度东亚飞蝗抗菌活性物质的浓度c＝（1．45A280－0．74A260）×稀释倍数＝（1．45×2．092－0．74×2．507）×10＝11．782mg／mL2．6抗菌活性物质的收率蝗虫抗菌活性物质收率＝c•V／m×100％＝11．782×69．6÷9509．35＝8．623％。

讨论

20世纪60年代，人们开始重视昆虫免疫的研究。但目前国内外对昆虫抗菌活性物质的研究主要集中在果蝇、家蚕、蜜蜂、粉纹夜蛾等基础研究上，对东亚飞蝗抗菌肽类物质的提取、功能、体外表达及活性检测的研究鲜见报道。云南地处中国西部地区，对蝗虫物种多样性的研究比较全面、深入，蝗虫资源基本清楚。东亚飞蝗属昆虫纲，直翅目，蝗科昆虫，雌雄异体，成虫后善跳、善飞。主要采食禾本科与莎草科植物，喜食的农作物主要有玉米、谷子等禾本科植物，是我国重要的农业蝗虫［9］。本研究以东亚飞蝗为试验材料，萃取抗菌活性物质和研究抑菌效应，为进一步研究东亚飞蝗新型抗菌肽积累基础试验数据。昆虫免疫系统具有对外源物质的免疫应答能力，一些外源物质或因素均能诱导昆虫产生抗菌活性物质。昆虫在机体受到损伤时，会产生抗菌肽，平时也会在表皮、口腔、肠道和生殖道等不同部位表达产生一定量抗菌肽，使共生的自然菌落处于稳定状态［10－11］，与本试验研究结果一致，即没有针刺蘸大肠杆菌诱导的东亚飞蝗粗提液也能产生抗菌作用，表明东亚飞蝗血淋巴中抗菌活性物质的产生可能受某种基因的调控。本试验结果显示，针刺蝗虫腹部，浸泡在大肠杆菌菌悬液中能显著提高蝗虫粗提液的抑菌效果，其中针刺蝗虫腹部后饲养24h抑菌活性最强。昆虫抗菌活性物质对细菌的作用主要是破坏细胞膜，通过具有α－螺旋结构的双亲性蛋白质改变细菌质膜的渗透性发挥作用，不同于青霉素等抗生素是阻断大分子生物合成的抗菌机制，故不易产生耐药性。本试验通过牛津杯法证明，此类萃取物对临床多重耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定抑制作用，其中对革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌抑制效果最好，对其它几种临床多重耐药菌也有一定的抑制作用。研究表明，Moricin（丝蚕抗菌肽）对大肠杆菌JM109、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等13种细菌均有明显的抑制作用，而且它们的最小致死浓度均低于0．9μM［12］，与本试验结果基本一致。邱晓燕［13］从舍蝇幼虫中提取的抗菌肽可抑制金黄色葡萄球菌生长，但是对大肠杆菌、绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌均无抑制作用。而赵立苹［14］初步分离稻蝗抗菌肽对大肠杆菌等革兰氏阴性菌没有抑制效果，其原因可能与蝗虫品种及饲养条件有关。将蝗虫萃取物置于100℃水浴锅及－80℃不同温度下，对其活性影响不大，证明其具有一定的耐热耐寒稳定性，具有较大研发和应用潜力。党向利［15］从诱导的家蝇蛹的粗提液中分离纯化出了4种抗菌物质，即3个抗菌肽和1个抗菌化合物。3个抗菌肽分别是分子量为11992．48Da的IA，家蝇defensin和分子量为7988．43Da的IIB。应用RT－PCR技术对4种抗菌肽／蛋白基因在家蝇蛹内表达进行了研究，明确了家蝇蛹体内cecropin、defensin和attacin等抗菌肽的表达是诱导型的，而lysozyme是组成型表达。应用生物信息学方法，证实了家蝇defensin具有典型的昆虫防御素空间构象，即αββ结构。骆雪等［16］研究表明，东亚飞蝗抗菌活性物质可成功诱导LPS刺激猪免疫应激细胞β－defensins－1（pBD－1），pBD－2和pBD－3基因表达上调，结果为改善动物抗病能力提供了有效途径。结合本试验结果，提示东亚飞蝗提取的抗菌活性物质可能治疗某些细菌性疾病，而且不易产生耐药性，这是抗生素替代品未来研究发展的一个重要方向。在本试验基础上，进一步研究东亚飞蝗抗菌活性物质的抗菌谱与最小抑菌浓度，研究东亚飞蝗抗菌肽的抗病作用机理，可成功诱导机体抗病基因的表达，改善机体免疫性能和提高抗病能力。4结论针刺诱导东亚飞蝗成虫和饲养不同时间后提取液的抑菌活性具有明显差别，东亚飞蝗成虫提取液对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌均有抑制作用，其抗菌谱为：金黄色葡萄球＞水稻白叶枯病原菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌，其中以针刺诱导饲养24h后的抑菌效果最明显，东亚飞蝗抗菌活性物质粗提液经纯化后增强抑菌效果。结果提示：东亚飞蝗体内含有抗菌活性物质，具有可诱导性，但其抗菌作用机理有待进一步研究。

作者：骆雪 张春勇 陈克嶙 郭荣富 单位：云南农业大学