微小核糖核酸21在非小细胞肺癌中的表达及意义

[摘要] 目的 探讨微小核糖核酸21（miR-21）在非小细胞肺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。 方法 应用qRT-PCR方法检测120例非小细胞肺癌标本和120例癌旁肺组织标本中miR-21的表达水平。 结果 miR-21在非小细胞肺癌组织中的表达水平明显高于其在癌旁肺组织中的表达水平（P = 0.0060）。miR-21的表达情况与非小细胞肺癌患者TNM分期（P=0.0063）、癌细胞分化（P=0.0410）及淋巴结转移（P=0.0197）相关，与性别、病理类型和肿瘤直径无关（均P >0.05）。 结论 非小细胞肺癌组织中miR-21表达异常提示其可能参与了非小细胞肺癌的发生、发展过程，是一个潜在的非小细胞肺癌分子标志物。

[关键词] 非小细胞肺癌；microRNA；微小核糖核酸21；qRT-PCR

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（c）-0132-03

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占所有肺癌的80%[1]。自Croce研究组2002年首次报道微小核糖核酸（microRNA，miRNA）异常与肿瘤有关以来[2]，越来越多的研究表明，miRNA在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。已有研究证实，微小核糖核酸21（miR-21）在甲状腺状癌、肝癌等多种恶性肿瘤中表达显著上调，且与肿瘤分级呈正相关[3-4]。但目前关于miR-21与NSCLC是否相关的报道较少。本研究拟用实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测miR-21在NSCLC组织中的表达，初步探讨miR-21表达与NSCLC的发生、分化及转移的关系，为进一步有效诊断和防治肺癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2007年10月～2011年10月经手术切除的120例NSCLC标本，同时收集上述病例癌旁肺组织120例，所有患者均经术后病理检查证实，且术前均未接受过放化疗或靶向治疗，均有详细的临床资料和手术记录。

1.2 实时荧光定量PCR法

用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取标本总RNA，miR-21的表达水平采用文献报道的qRT-PCR法进行检测[5]，以U6的小RNA作为内参，采用相对CT值表示[6]。qRT-PCR的操作严格按照SYBR TaqTM预混试剂盒（日本Takara公司）说明书进行。所有标本均于术后30 min内获得，用无RNA酶水冲洗以清除可能污染的瘤细胞，液氮速冻后-80℃冰箱保存。严格按照试剂盒的说明和实验操作要求提取组织RNA及进行cDNA 逆转录。miR-21茎环逆转录引物序列为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3′；PCR扩增上游引物序列为 5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′ ，下游引物序列 为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6茎环逆转录引物序列为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAAATATG-3′；PCR扩增上游引物序列为5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微小核糖核酸21在非小细胞肺癌组织和癌旁肺组织中的表达情况

miR-21在NSCLC组织中的相对表达水平高于癌旁肺组织，两者差异有统计学意义（P = 0.0060）。见表1。

2.2微小核糖核酸21表达水平与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

miR-21的表达情况与NSCLC患者TNM分期（P = 0.0063）、癌细胞分化（P = 0.0410）及淋巴结转移（P = 0.0197）相关，与性别、病理类型和肿瘤直径无关（均P >0.05）。见表2。

3 讨论

随着人类后基因组计划的开展，占人类基因组99%的非编码序列日益受到关注，其中，miRNA的发现最引人注目。miRNA是一类全长为19～25 nt的单链小分子RNA，广泛存在于病毒、植物及高等哺乳动物中[7]。自1993年Lee等[7]发现了第一个小分子非编码RNA以来，到2006年人类已发现了超过500种miRNA，可能调控人类基因组中30%的编码基因[8-9]。目前miRNA已知的功能主要是作为基因表达的负调控因子，参与细胞的增殖、凋亡、分化及代谢，但其作用靶点及确切的生物功能尚不明确[10]。研究显示，miRNA可能作为潜在的癌基因或抑癌基因参与多种肿瘤的发生过程[11]。miR-21位于染色体的脆性区域17q23.2，已证实其在多种肿瘤，如甲状腺状癌、肝癌等中表达水平显著上升，发挥着癌基因的作用[3-5]。

Yanaihara等[11]利用基因芯片分析发现，NSCLC组织中有43种mi-RNA表达异常，其中，miR-21表达升高。Seike等[12]在不吸烟者肺癌病例中检测出miR-21呈过表达。本研究结果显示，miR-21在NSCLC组织中表达水平高于癌旁肺组织（P = 0.006），与以上研究结果一致，进一步证实了miR-21的癌基因作用。但以往研究未涉及miR-21与NSCLC患者临床病理特征的关系。本研究发现，miR-21表达情况与NSCLC患者TNM分期、癌细胞分化程度及淋巴结转移相关（均P < 0.05）。这些病理特征都与肿瘤的发生、发展和不良生物学行为密切相关，其中，淋巴结转移更是患者预后不良的重要标志，提示NSCLC组织中miR-21的高表达可能预示患者的不良预后。有学者提出miR-21通过抑制肿瘤抑制基因TPM1和PDCD4促进乳腺癌肿瘤细胞的增殖，但对于miR-21在肺癌组织中的靶基因相关研究较少[13-14]。徐晓明等[15]通过miRNA 芯片与生物信息学技术人工合成 miRNA-21序列，转染至肺癌A549 细胞中，检测细胞 PTEN 基因 mRNA 转录和蛋白的表达水平，发现miR-21可能主要在翻译调控PTEN 基因的表达。

总之，miR-21在NSCLC组织的表达水平明显上升，且与NSCLC的TNM分期、癌细胞分化程度及淋巴结转移显著相关，证明其可能参与了NSCLC发生、发展过程，是一个潜在的NSCLC分子标志物。同时，miR-21是第1个被发现的血清miRNA标志物[16]，有望用于NSCLC的早期诊断及预后判断。

[参考文献]

[1] Jemal A，Murray T，Ward E，et al. Cancer statistics， 2005 [J]. CA Cancer J Clin，2005，55（1）：10-30.

[2] Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia [J]. Proc Natl Acad Sci，2002，99（24）：15524-15529.

[3] Iorio MV，Ferracin M，Liu CG，et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer [J]. Cancer Res，2005，65（16）：7065-7070.

[4] Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al. MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppress or gene in human hepatic cellular cancer [J]. Gastroenterology，2007，133（2）：647-658.