抵抗素基因-420C>G位点多态性对脑出血患者血浆抵抗素浓度的影响

[摘要] 目的：探讨抵抗素基因-420C>G位点单核苷酸多态性对脑出血患者血浆抵抗素水平的影响。方法：选取344例高血压性基底节出血患者，入院时抽取外周血提取DNA，采用聚合酶反应-限制性片断多态性分析基因型，同时采用ELISA法检测血浆抵抗素浓度，进行统计分析。结果：酶切后可见抵抗素基因-420C>G位点有CC、CG和GG三种基因型，等位基因C和G的频率分别为71.08% 和28.92%，基因型CC、CG和GG的频率依次为为50.29%、41.57% 和8.14%。经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各基因型频率符合遗传平衡。CC、CG和GG基因型患者血浆抵抗素浓度依次为（23.83±7.09）ng/mL、（26.54±7.32）ng/mL和（27.18±9.97）ng/mL。CC基因型患者血浆抵抗素均显著低于CG和GG基因型患者（P

[关键词] 抵抗素基因多态性脑出血炎症反应

中图分类号：R743.34文献标识码：A文章编号：1009-816x

抵抗素是一种首先发现由白色脂肪细胞分泌的肽类激素，可表达于脑外伤及脑缺血动物脑皮层，参与炎症反应[1, 2]。我们最近研究发现，脑出血患者血浆抵抗素水平升高，且与预后显著相关[3]。抵抗素基因启动子区-420C>G位点单核苷酸多态性可以影响抵抗素基因启动子的活性，增加血液及组织中抵抗素的表达，从而影响其生物学效应[4-8]，但其与脑出血相关研究少见报道。本研究运用限制性内切酶方法，对抵抗素基因-420C>G位点进行多态性分析，旨在揭示抵抗素基因-420C>G位点多态性对脑出血后血浆抵抗素浓度的影响，为脑出血继发性脑损伤研究提供遗传学基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料： 脑出血病例选自2007年1月至2009年12月杭州市第一人民医院和慈溪市第二人民医院神经外科收治的高血压性基底节出血患者，共344例。脑出血病例一般情况及临床资料见表1，均除外既往脑卒中、使用抗凝剂、严重感染、严重心肝肾疾病及严重头部外伤史。

1.2 方法： 脑出血病例静脉血在入院时获得。血标本立即放入无菌EDTA试管中，在4℃、1500转/分、离心20分钟收集血浆，储存在-70℃环境中待检。ELISA法测定血浆抵抗素浓度，试剂购于美国R&D systems公司。使用美国Stratagene公司生产的DNA提取试剂盒提取脑出血患者外周血DNA，利用PCR-RFLP法分析抵抗素基因-420C>G位点基因多态性。根据人抵抗素基因特异序列设计引物，上游引物5'-TGT CAT TCT CAC CCA GAG ACA-3'，下游引物5'-TGG GCT CAG CTA ACC AAA TC-3'，扩增片段长度534bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR扩增试剂盒为美国MBI fermentas 公司生产，共20 μl，含0.1 mmol/L dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶、MgCl22 mmol/L、上下游引物各 0.25 μmol/L、DNA模版约 200 ng。PCR反应条件：95 ℃ 变性7 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共循环35次，末次循环后72 ℃再延伸10 min。取扩增产物3 μl，用限制性内切酶BbsⅠ（为美国NEB公司产品）5 U对PCR扩增产物在37 ℃下酶切12 h。将酶切产物点样于琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察结果、摄片，分析基因型。

1.3 统计学处理： 采用SPSS 10.0版统计软件分析，计量资料行正态检验，正态分布数据以（平均值±标准差）表示，采用方差分析。非正态分布数据以中位数（上四分位数，下四分位数）表示，采用Kruskal - Wallis H test检验。分类资料比较和Hardy-Weinberg平衡采用卡方检验。P

2. 结果

2.1 抵抗素基因-420C>G位点多态性分析： 脑出血病例PCR产物均可见预期的534 bp的片段。经限制性内切酶BbsⅠ对PCR扩增产物进行酶切后产物电泳共获得3种基因型，CC型：缺乏BbsⅠ酶切位点，酶切后仅见与PCR产物一样的534 bp的片段；GG型：含有Bbs Ⅰ酶切位点，酶切后可见327 bp 和207 bp两条片段；CG型：杂合型，酶切后可见534 bp、327 bp 和207 bp 3条片段。脑出血病例等位基因C和G的频率分别为71.08% 和28.92%，基因型CC、CG和GG的频率依次为为50.29%、41.57% 和8.14%，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性。

2.2 抵抗素基因-420C>G位点多态性对血浆抵抗素水平的影响：经方差分析，CC基因型患者血浆抵抗素均显著低于CG和GG基因型患者（P

3. 讨论

脑出血后继发性脑损伤的病理生理机制复杂，涉及很多方面。炎症反应是脑出血后继发性脑损伤的重要组成部分。脑出血后，补体、凝血酶和纤维蛋白降解产物等可诱发一系列炎症反应，从而白介素-6、白介素-10、肿瘤坏死-α等许多炎症因子浓度升高，血脑屏障通透性增加，脑水肿加重，导致神经细胞凋亡，加重脑损伤[3]。

抵抗素是一种主要由白色脂肪细胞分泌的肽类激素，与Ⅱ型糖尿病、胰岛素抵抗、高血压、肥胖、脂质代谢异常等有关[9-13]。近年来研究表明抵抗素在外周血单核细胞中高表达，并与多个炎性标志物相关，提示抵抗素是一种前炎性细胞因子，可能以一种代谢信号的方式表达潜在的炎性作用，引起多系统炎性相关性疾病 [9-13]。在小鼠缺血脑损伤中，损伤同侧大脑皮质和海马区抵抗素表达明显增加[1]。在大鼠创伤性脑损伤中，损伤同侧和对侧海马区抵抗素mRNA水平显著增加[2]。我们研究发现，脑外伤及脑出血患者血浆抵抗素水平升高，且与预后显著相关[3, 12]。最近研究发现，脑外伤患者血浆抵抗素浓度和超敏C-反应蛋白显著相关[13]。这些提示，抵抗素在脑损伤后炎症反应中具有重要角色。

人抵抗素基因定位于19p13.2，内含子边界序列均高度保守，其mRNA含476个碱基对，其编码区含有326个碱基对，编码108个氨基酸。人的抵抗素基因存在多种单核苷酸多态性现象，如-420C>G，+299G>A和-638G>A等。其中-420C>G被认为是影响抵抗素基因表达的主要多态性位点，可影响启动子的活性，增加血液和组织中抵抗素的表达，从而影响其生物学效应[4-6]。血清抵抗素水平在GG基因型表达最高，其次是CG型，CC型表达最少[7]。研究发现，GG基因型可增加其转录因子 Sp1和Sp3的结合活性，从而增加抵抗素的表达[7]。抵抗素-420C>G基因多态性可能与2型糖尿病、肥胖和冠心病等易感性相关[4-8]。本研究脑出血患者各基因型组间基线资料、临床资料及常规化验结果等混淆因素差异无统计学意义，但抵抗素基因-420C>G位点单核苷酸多态性显著影响脑出血患者血浆抵抗素浓度。提示抵抗素基因-420C>G位点单核苷酸多态性可能参与脑出血后的炎症反应。

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