Nec―1对冈田酸诱导的大鼠皮层神经元损伤的保护作用

摘要：目的 观察Nec-1对冈田酸（OA）诱导的大鼠皮层神经元损伤是否有保护作用。方法 采用原代皮层神经元培养方法，通过检测细胞活力、乳酸脱氢酶（LDH）释放及Calcein-AM染色观察Nec-1对OA诱导大鼠皮层神经元损伤的抑制作用。结果 Nec-1（100 μmol/L）抑制OA引起的细胞活力的降低，使其增加19%（P

关键词：坏死性凋亡；necrostatin-1；冈田酸；神经元损伤

中图分类号：R329.3 R277.7 文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.047

文章编号：1672-1349（2014）04-0476-02

生理条件下，蛋白磷酸酶2A （PP2A）与蛋白激酶调节微管相关蛋白tau 蛋白磷酸化水平，处于低水平磷酸化的动态平衡[1]。冈田酸（okadaic acid，OA）是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，对PP2A有特异性抑制作用[2]。OA能使神经元tau 蛋白异常过度磷酸化，继而引起神经元毒性[3]。

Degterev等[4]研究发现，在细胞内不存在凋亡信号时，Fas/TNFR能活化一种非凋亡的死亡途径，称为坏死性凋亡（necroptosis）。同时，他们发现一种小分子物质necrostatin-1（Nec-1）可以特异且有效地抑制坏死性凋亡。本研究旨在探讨Nec-1对OA诱导的神经元损伤是否有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM/F-12和胎牛血清（Gibco-BRL）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、calcein-AM（Dojindo）；OA、阿糖胞苷、多聚赖氨酸、Nec-1（Sigma）；胰蛋白酶（Biosharp）；乳酸脱氢酶（LDH）（南京建成生物工程研究所）。

1.2 原代细胞培养 取新生1 d～3 d Wistar大鼠，分离大脑皮层，用胰酶消化制备单细胞悬液。细胞悬液经1 000 r/min离心5 min，弃上清，用完全培养液（DMEM/F-12 培养基+15%胎牛血清）重悬细胞。然后接种于培养瓶或培养板上，在37 ℃，5%CO2的孵育箱培养。24 h后加入10 μmol/L阿糖胞苷。成熟的神经元（8 d～10 d）用于实验。

1.3 实验分组 将Wistar大鼠分为5组，对照组、OA组（10 nmol/L）、Nec-1组在加入OA前24 h加入不同浓度的Nec-1（10 μmol/L，30 μmol/L，100 μmol/L）预孵育。

1.4 细胞活力检测 细胞在96孔板培养（100 μL/孔），向各孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃，5%CO2的孵育箱孵育2 h，用酶标仪测定490 nm处OD值。

1.5 LDH的检测 当细胞遭受损伤时，LDH由胞浆释放到胞外。加入OA 24 h后，收集培养液检测LDH活性。

1.6 calcein-AM染色 细胞与calcein-AM避光孵育20 min，PBS避光洗涤两次，在490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜下观察细胞。

1.7 统计学处理 计量资料用均数±标准差（x±s） 表示。组间比较采用单因素方差分析，P

2 结 果

2.1 Nec-1抑制OA引起的细胞活力的下降 CCK-8细胞活力检测发现OA引起皮层神经元损伤。与对照组相比，将神经元暴露于OA 2 h，细胞活力降至（52.55±2.86）%（P

3 讨 论

阿尔兹海默病（AD）是引起老年期痴呆最常见的原因。随着我国人口结构的逐步老龄化，该病的高发病率和危害性也越来越被关注。其主要的病理特征是脑内出现老年斑和神经纤维缠结（NFT）[5]。过度磷酸化的tau蛋白是形成神经纤维缠结的主要成分，在AD 发病中发挥重要作用[6]。

PP2A是脑内调节tau蛋白去磷酸化的主要磷酸酶[7]。研究报道，AD 病人脑中PP2A活性降低30%左右。PP2A活性降低是导致AD病人tau蛋白过度磷酸化的主要原因[8]。OA是一种特异性的PP2A抑制剂，在体内或体外条件下，OA可使神经细胞内微管相关蛋白tau 过度磷酸化，最终导致神经细胞退化[9]。

坏死性凋亡是新近发现的一种细胞死亡方式，Nec-1为其特异且有效的抑制剂，有可能成为临床治疗疾病的一个新靶点[4]。研究发现Nec-1可抑制中风模型或创伤性脑损伤（TBI）模型中的脑损伤[10，11]。

前期研究也发现Nec-1抑制NMDA诱导的兴奋性神经毒作用[12]。

本研究发现Nec-1可以抑制OA诱导的大鼠皮层神经元损伤。已证实Nec-1抑制OA引起的细胞活力的降低、LDH释放和活细胞数的减少。这些结果均表明Nec-1对OA诱导的大鼠皮层神经元损伤有保护作用。Nec-1为坏死性凋亡的特异性抑制剂，证明在OA诱导tau蛋白磷酸化引起的神经元损伤中，坏死性凋亡起着重要作用，可以为AD疾病的治疗提供新的靶点。

Tau蛋白过度磷酸化使tau蛋白结合微管能力降低[13]，神经元轴突转运障碍[14]，导致神经元呈慢性进行性变性。本研究表明在神经元变性过程中有坏死性凋亡的参与。尽管其作用可能只占其中一部分，但坏死性凋亡级联反应是可调节的，所以它可能会为AD的治疗提供一个新的甚至更有效的靶点。〖HJ*4〗

参考文献：

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[10]Degterev A，Huang Z，Boyce M，et al.Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J].Nat Chem Biol，2005，1（2）：112-119.

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