G―CSF对创伤性脑损伤大鼠神经再生作用的研究

摘要：目的 探讨应用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）治疗对创伤性脑损伤（TBI）大鼠模型神经功能恢复及神经细胞再生的作用。方法 将60只健康雄性Wistar大鼠随机分成假手术对照组、脑创伤对照组、G-CSF治疗组。采用Feeney法制备中度脑创伤模型，G-CSF治疗组在大鼠脑创伤后立即给予G-CSF 50 μg/（kg・d），两对照组给予等量的生理盐水，连续3 d。通过BrdU标记新生增殖细胞，于术后1 d、4 d、7 d、14 d对各组大鼠进行神经功能缺失评分（mNSS），并取大鼠脑组织行HE染色观察脑组织病理改变，免疫组织化学荧光法进行BrdU染色、BrdU/NeuN双染色检测新生增殖细胞及其分化方向。结果 G-CSF治疗组4 d、7 d、14 d时mNSS评分明显低于脑创伤对照组（P

关键词：创伤性脑损伤；粒细胞集落刺激因子；神经再生

中图分类号：R651.1 R269 文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.049

文章编号：1672-1349（2014）04-0480-03

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是神经外科的急危重症，也是导致青壮年死亡和致残的主要病因之一[1]。大量的研究表明，继发性脑损伤是致死和致残的重要原因，脑创伤后引起的继发性脑水肿、神经炎症反应及神经细胞凋亡等都可以再次加重脑损伤[2]。近年来随着研究的深入，粒细胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）作为一种神经保护因子成为了研究的热点。G-CSF是一种造血生长因子，临床上主要用于治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症以及动员外周血干细胞移植治疗免疫性疾病。研究显示，在脑缺血时G-CSF能够减少脑梗死面积，促进神经功能恢复[3]。但G-CSF在创伤性脑损伤方面的研究还很少见，具体机制尚不清楚。因此，本实验尝试用G-CSF治疗创伤性脑损伤，探讨G-CSF在创伤性脑损伤促进神经再生方面的作用，为临床应用G-CSF治疗创伤性脑损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制备

1.1.1 实验动物及分组 健康成年雄性Wistar大鼠60只，清洁级，体重220 g～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供。随机分成3组：假手术对照组（Sham组）、脑创伤对照组（TBI组）、G-CSF治疗组（G-CSF组），每组20例；然后按照术后1 d、4 d、7 d、14 d随机分为4个亚组，每个亚组5只。Sham组仅暴露右顶骨，并于右顶骨钻一直径5 mm骨孔即可；G-CSF组制备模型后立即腹腔注射G-CSF（齐鲁制药厂）50 μg/（kg・d），共3 d；TBI组制备模型后立即腹腔注射等量0.9% NaCl，共3 d。另外，各组大鼠于实验开始给予每日腹腔注射BrdU（北京博奥森）50 mg/（kg・d），连续5 d。

1.1.2 模型制备 按Feeney法[4]自由落体致伤原理制备大鼠中度TBI模型，用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，取俯卧位，将大鼠固定在脑立体定位仪（日本成贸公司）上，顶部备皮，碘伏消毒，沿正中线切开头皮、剥离骨膜，暴露右顶骨。用牙科台式电钻（宁波医疗器械厂）于冠状缝后1.5 mm，中线右旁2.5 mm处钻一直径约5 mm的圆形骨窗，保持硬脑膜完整，将撞击装置（军事医学科学院仪器厂加工）的撞杆头端置骨窗外，以0.048 N・s（20 g重锤，30 cm高度）冲击力撞击大鼠右侧脑部中央前回皮层，然后用骨蜡封闭骨孔，切口缝合。撞杆打击后大鼠立即出现脑组织膨隆，硬脑膜未破裂，认为打击有效。术后每只大鼠肌肉注射硫酸庆大霉素4×104 U，以防感染。假手术组大鼠接受同样的手术操作，但是不用撞杆撞击。

1.2 神经功能评价 各组大鼠于术前1 d及术后1 d、4 d、7 d、14 d时，严格按照经典的神经功能缺失评分（mNSS）标准[5，6]，分别通过感觉、运动、平衡木测试及反射活动等进行评分，各项总分相加为行为评定总分，最高18分，最低3分，分数越低，说明神经功能恢复越好。

1.3 脑组织免疫荧光染色

1.3.1 石蜡标本制备 各组大鼠均于术后1 d、4 d、7 d、14 d时处死，取脑组织制备石蜡标本。过程如下：大鼠麻醉后暴露心脏，左心室插管，剪开右心耳放血，用生理盐水快速心脏灌注，见右心耳流出清亮液体后，改用4%多聚甲醛灌注固定，固定好后取脑组织置于4%多聚甲醛溶液内固定24 h，常规脱水、石蜡包埋、切片，行BrdU及BrdU/NeuN免疫荧光染色。

1.3.2 BrdU单标染色 脑组织石蜡切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内源性过氧化氢酶，高压枸橼酸盐热修复2 min 40 s，5%正常山羊血清（武汉博士德）室温孵育30 min倾去勿洗，滴加1∶100 的小鼠抗BrdU一抗（北京博奥森）4 ℃冰箱过夜，PBS洗5 min×3次，滴加1∶50的山羊抗小鼠IgG荧光FITC二抗（北京博奥森），避光37 ℃温箱孵育60 min，PBS洗8 min×3次，缓冲甘油封片，荧光显微镜（OLYMPUS公司）下观察并采集图片。每张切片在脑损伤周围随机取5个视野，计数阳性细胞数。

1.3.3 BrdU/NeuN双标染色 同上5%正常山羊血清封闭后，滴加1∶100 的小鼠抗BrdU和1∶150兔抗大鼠NeuN（北京博奥森）混合一抗，4 ℃冰箱过夜，PBS洗5 min×3次，滴加1∶50的山羊抗小鼠IgG荧光FITC和1∶50山羊抗兔IgG荧光CY3（北京博奥森）混合二抗，避光37 ℃温箱孵育60 min，PBS洗8 min×3次，缓冲甘油封片，同上荧光显微镜下观察并计数双阳性细胞数。

1.4 统计学处理 运用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行处理，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，采用析因设计的方差分析，组间比较用LSD-t检验，P

2 结 果

2.1 神经功能评分 脑创伤后大鼠都有不同程度的神经功能缺失，术后2 d最重，后随时间延长逐渐恢复。G-CSF组在第1 d时mNSS评分和TBI组比较差异无统计学意义，于第4 d、7 d、14 d时mNSS评分明显低于TBI组，差异有统计学意义（P

3 讨 论

近年来研究发现，G-CSF及其受体（G-CSFR）在正常脑组织中有少量表达，当脑组织受到损伤时，可见损伤灶及周围脑组织G-CSF/G-CSFR表达明显增加，给予外源性的G-CSF可以通过血脑屏障，并结合于神经细胞膜上的G-CSFR，通过一系列信号转导发挥神经保护作用[7，8]。另有研究证实鼠G-CSF与人类G-CSF的蛋白序列同源性高达73%，可以将重组人G-CSF用于大鼠或小鼠实验[9]。这些证据为本实验应用G-CSF提供了实验依据。

目前研究发现在大鼠海马齿状回的颗粒下区和室管膜下区存在多向分化潜能的神经干细胞[10]。脑损伤时，这些区域干细胞可以在各种细胞因子的作用下迁徙到脑组织损伤区，分化为神经细胞，从而促进神经功能恢复，但这种自身修复能力极为有限。BrdU是胸腺嘧啶类似物，可以替代胸腺嘧啶在细胞DNA合成期（S期）渗入到细胞核内，并稳定存在于细胞核DNA上，对细胞增殖没有影响[11]；NeuN即神经元白，是神经元特异性标志蛋白。因此，本实验利用BrdU阳性细胞作为新生增殖细胞的标志，BrdU/NeuN双阳性细胞表示新生神经细胞分化为神经元，应用免疫荧光技术对创伤周围脑组织阳性细胞进行计数。研究发现Sham组几乎找不到BrdU阳性细胞，TBI组偶见创伤周边有BrdU阳性细胞，表明正常情况下脑组织几乎没有神经细胞再生，而在脑损伤时，由于损伤刺激可诱导细胞增殖，但新生细胞数量很有限。本实验结果也表明，G-CSF组创伤脑组织周围BrdU阳性细胞在用药以后明显增多，7 d时达到高峰，并明显高于TBI组和Sham组；在促进新生细胞向神经元分化方面，G-CSF组也具有明显的优势。Khatibi等[12]研究结果也表明G-CSF治疗可明显减少脑创伤后细胞死亡和脑水肿。另外G-CSF组大鼠mNSS评分明显减低，并与TBI组相比差异有统计学意义，这可能与G-CSF减轻脑组织损伤和增加神经细胞再生密切相关。Yang等[13]研究也发现在脑创伤后给予G-CSF能明显提高细胞增殖和运动功能恢复。还有研究发现G-CSF能动员骨髓间充质干细胞进入外周血，并促进其向脑损伤区迁徙分化成神经细胞，对损伤脑组织进行修复[14]。本实验也发现创伤灶及周围脑组织有新生神经细胞，但这些新生的细胞是来源于骨髓干细胞还是内源性干细胞还有待进一步研究证实。

综上所述，创伤性脑损伤后给予G-CSF辅助治疗，能显著提高创伤后神经功能恢复，促进创伤脑组织周围细胞增殖，并向神经元分化。 为临床应用G-CSF治疗创伤性脑损伤提供了理论依据，具体机制还需进一步研究。

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