CRISPR/Cas9系统对斑马鱼fhl1a基因敲除有效性的研究

摘 要 为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用，利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl

>> CRISPR/Cas系统 利用CRISPR/Cas9建立肠癌抑制基因Mindin的稳定敲除细胞株 展望CRISPR/Cas9基因编辑技术在药用植物研究中的应用 基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展 基因组编辑系统CRISPR―Cas9研究进展及其在猪研究中的应用 浅谈CRISPR/Cas9技术在基因工程中的应用 CRISPR/Cas9：一种新型的基因组定点编辑技术 一种玉米CRISPR/Cas9载体的构建 CRISPR/Cas基因组靶向编辑技术综述 CRISPR系统在染色体标记方面的应用 对JTIDS系统干扰有效性研究 活血解毒中药有效部位对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块炎症反应的影响 CAS理论视域下高校思想政治理论课教学设计有效性研究 苯酚对斑马鱼的 核转染仪辅助转染肝素酶基因siRNA有效性的实验研究 三氯杀虫酯对斑马鱼毒性的研究 新课程下提高“鱼”“渔”授之的有效性 地理必修1活动系统分析及有效性策略探究 对“探究性学习”有效性的研究 浙江省农业生产系统的有效性研究 常见问题解答 当前所在位置：l）网站获得斑马鱼目标基因的完整序列、该基因组上的位置、基因的转录本、编码序列、编码蛋白、功能域和结构域等信息；用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站对目的基因的信息进行核实与补充.CRISPR/Cas9系统中gRNA靶位点设计需要遵循如下原则：靶位点处以18～20个碱基为最佳；PAM区其序列必须严格要求为NGG（N可以为任意碱基）；所选靶位点位置一定要在该基因编码蛋白的功能结构域内部或之前的位置所对应的核苷酸序列，或是尽量靠前的位置，一般来讲，靶位点要在该基因CDS区前2/3区域的外显子中，起始密码子之后，同时注意避免首个起始密码子下游还存在其他拥有相同读码框的起始密码子.如果该基因编码多种蛋白，所选靶位点应尽量能同时破坏其所有编码蛋白的结构域.另外，靶位点也可选在外显子和内含子交界处，也可能破坏基因的剪接.靶位点处的碱基序列最好具有一定的复杂性，没有过多的连续重复.符合这些要求的靶位点需要在NCBI中斑马鱼全基因组上进blast， 以确定其单一性和减少脱靶效应.其中PAM区以及靠近PAM区部分的序列较为重要，比较不同靶位点各种参数后择优使用.

1.2.2 gRNA的制备 将质粒p42250 通过BsaⅠ进行酶切（ 37 ℃水浴2 h）.酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳回收后作为PCR的模板.以公司合成的fhl1a-oligo-1，fhl1a-oligo-2引物（见表1）分别作为F端引物，序列（AAGCACCGACTCGGTGCACT）作为R端引物，退火温度54 ℃，延伸时间30 s，高保真酶进行PCR扩增，之后用试剂盒纯化PCR产物作为模板，T7启动子进行体外转录，体外转录产物使用RNA纯化剂盒进行纯化回收，1%琼脂糖电泳检测以及RNA浓度测定之后置于-80 ℃冰箱待用.

1.2.3 Cas9 mRNA的制备 将质粒h-Cas9 通过XbaⅠ进行酶切（ 37 ℃水浴2 h），使之线性化.之后用DNA纯化试剂盒进行回收溶于RNase Free 的ddH2O中作为模板，参照T7 Ultra Kit （Ambion，AM1345） 使用说明书进行体外加帽转录.体外转录产物使用RNA纯化试剂盒进行纯化回收，1%琼脂糖电泳检测以及RNA浓度测定之后置于-80 ℃冰箱待用.

1.2.4 靶位点有效性检验 按照约300 pg Cas9 mRNA和30 pg sgRNA剂量混合注射到斑马鱼胚胎一细胞期的单细胞中，注射后的胚胎培养72 h后，收集部分胚胎进行检测，并用野生型胚胎作为对照组.收集好的胚胎经过裂解提基因组DNA，用引物fhl1a-PCR-F（AATCCACCACTGTTCTGTT）和fh1a-PCR-R（GGAGTACAAGCATAAAGTC）进行PCR扩增，然后T7E1酶进行酶切检测.

1.2.5 突变个体筛选 待有效性检测为阳性的那一批斑马鱼长成至三个月后进行单个个体剪尾提取基因组测序.若测序结果显示有双峰即表明有碱基的插入或缺失，再将测序有双峰的样品与PMD18-T克隆载体进行连接，进行转化后挑取10个单克隆进行PCR后再测序，根据BLAST结果判断靶位点具体碱基突变情况.

2 结果

2.1 gRNA靶位点的确定及打靶载体的构建

按照1.2.1所述方法择优选取两个靶位点，在设计好的靶位点序列之前加上保护碱基tg和T7启动子，靶位点之后加上gRNA骨架上游序列作为正向引物，gRNA骨架的下游序列为反向引物进行扩增， fhl1a-PRC-F/R 为鉴定基因型所用扩增引物序列（见表1、图1A和1B）.

2.2 sgRNA活性检测及突变个体的筛选

按照约300 pg Cas9 mRNA和30 pg sgRNA剂量混合注射到斑马鱼胚胎一细胞期的单细胞中，并对注射情况以及鱼卵存活状态进行统计分析见表2所示.

待注射胚胎培养到72 h，随机提取部分斑马鱼全胚胎基因组，5个胚胎为一组，共6组进行打靶位点的有效性检测.若此打靶位点有效则继续让斑马鱼生长至两个月大剪尾提取基因组筛选突变个体.

按照1.2.4所述方法将6组注射fhl1a-Cas9-sgRNA的72 h胚胎提取基因组标号为1～6号以及1管野生型胚胎作为对照组，之后用T7E1酶进行酶切，结果见图2.

将注射后检测有效的胚胎养至3个月龄左右即可筛选F0代阳性个体，通过剪尾鳍方法进行基因组鉴定（方法见1.2.5），其中fhl1a-Cas9-sgRNA-oligo1和fhl1a-Cas9-sgRNA-oligo1共注射后长大的成鱼46条，分别进行剪尾、提基因组进行扩增，目的条带大小为651 bp，PCR扩增产物测序，部分测序结果见图3.

由图3可知，fhl1a基因F0代胚胎的测序峰图中靶位点以及之后序列的峰图出现套峰，说明fhl1a基因的F0代存在突变.再将测序有双峰的样品与PMD18-T克隆载体进行连接，转化后挑取10个单克隆PCR后再测序，根据BLAST结果判断靶位点具体碱基突变位点，测序结果见图4.黑框表示为靶点；横线为缺失片段（-）；N为出现同种突变位点斑马鱼个体数.

2.3 稳定性遗传的检测

为进一步验证该技术造成的缺失是否可以稳定传代，笔者将这些F0代阳性嵌合体斑马鱼与野生型雄鱼杂交得到F1代，并培养至性成熟期.对F1代成鱼剪尾鳍，提取基因组DNA，进行PCR扩增测序，测序结果有双峰的进行TA克隆，将单克隆测序，结果显示有3种突变类型的斑马鱼获得了能稳定遗传的突变（见表3）.

综上，本文选择F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的1号缺失7 bp个体，F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的2号缺失8 bp个体以及F1-fhl1a-Cas9-sgRNA的3号缺失16 bp的这三种突变F1代来建立稳定的纯合子敲除品系，并用这三个fhl1a突变品系斑马鱼进行斑马鱼fhl1a基因在心脏发育中的功能研究.

3 讨论

CRISPR/Cas9系统相较于ZFNs[15]和TALENs[16]两种更简单方便，较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症，而且CRISPRs比TALENs和ZFNs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于 CRISPR的sgRNA只需要替换20个核苷酸就行，因此相较于TALENs和ZFNs具有更好的应用前景.

本研究在sgRNA靶点的筛选中，选择了位于fhl1a第三号外显子区域的位置.笔者选取了两个fhl1a基因的打靶位点并进行了共注射，目的是希望得到大片段缺失的fhl1a基因的突变体.但是后砑觳庵蟹⑾挚赡苤挥械诙个靶位点发挥了功能，因为笔者得到的突变体都位于2号靶位点附近，1号靶位点在这里并没有起作用.

注射fhl1a-Cas9-sgRNA后的斑马鱼F0代属于嵌合体，这就意味着并不是所有的细胞都发生了基因突变，若突变没有发生在生殖细胞中则不会产生遗传.因此笔者在F0代中筛选到了4种fhl1a敲除类型，而到F1代中只有3种敲除类型得到了遗传，说明10个碱基缺失的斑马鱼的生殖细胞并没有发生突变.F1代为生殖细胞遗传，不存在嵌合体现象，为杂合子，所以可用F1代 fhl1a-Cas9-sgRNA-1，2，3号三个品系来继续建立稳定敲除系.fhl1a基因敲除斑马鱼的成功构建为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的功能提供了研究材料.

参考文献：

[1] 贾顺姬，孟安明.中国斑马鱼研究发展历程及现状[J].遗传，2012，34（9）：1082-1088.

[2] GARCIA G R， NOYES P D， TANGUAY R L， et al. Advancements in zebrafish applications for 21st century toxicology[J]. Pharmacol Ther， 2016，161（2）：11-21.

[3] PEN A E， NYEGAARD M， FANG M， et al. A novel single nucleotide splice site mutation in FHL1 confirms an Emery-Dreifuss plus phenotype with pulmonary artery hypoplasia and facial dysmorphology[J]. Eur J Med Genet， 2015，58（4）：222-229.

[4] DOMENIGHETTI A A， CHU P H， WU T， et al. Loss of FHL1 induces an age-dependent skeletal muscle myopathy associated with myofibrillar and intermyofibrillar disorganization in mice[J]. Hum Mol Genet， 2014，23（1）：209-225.

[5] MALFATTI E L， OLIV M， TARATUTO A L， et al. Skeletal muscle biopsy analysis in reducing body myopathy and other FHL1-related disorders[J]. Neuropathol Exp Neurol， 2013，72（9）：833-845.

[6] CONG L， RAN F A， COX D， et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science， 2013，339（6121）：819-823.

[7] GASIUNAS G， BARRANGOU R， HORVATH P， et al. Cas9-crRNAribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proc Natl Acad Sci， 2012，109（39）：E2579-86.

[8] JINEK M， CHYLINSKI K， FONFARA I， et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity[J]. Science， 2012，337（6096）：816-821.