Skp2基因的研究进展

摘要：Skp2被称为S期激酶相关蛋白，属于F-box蛋白家族成员，在蛋白泛素化降解过程中可作为SCFSkp2复合物的重要成分起识别底物蛋白的作用，主要通过降解细胞周期调节蛋白介导细胞周期调控和细胞增殖。为更全面地了解Skp2的研究进展及开展其在动物科学与医学领域的研究，从Skp2基因的结构、功能、与人类肿瘤致病机理、转录调控和启动子方面的关系进行了综述。

关键词：Skp2基因；功能；转录调控；肿瘤；启动子

中图分类号：Q74；Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0502-06

1995年Zhang等[1]首次克隆了Skp2并命名为S期激酶相关蛋白。随后许多科研人员对其结构和功能进行了深入的研究，尤其是在人类疾病机理研究方面取得了较大的进展，证明Skp2在多种癌症细胞中过表达，对肿瘤的发生和发展具有重要作用；但在动物的正常发育和疾病研究方面却少有报道。该综述旨在为开展Skp2基因在动物科学及医学方面的研究提供一定的参考。

1 Skp2的结构

Skp2 （S-phase kinase-interacting protein）也被称为FBXL1，编码一个F-box蛋白。1995年首次由Zhang等[1]克隆并发现成纤维细胞处于S期的CyclinA-CDK2形成复合物完成其激酶功能时必须依赖于Skp2，因此被称为S期激酶相关蛋白。随后Demet等[2]又通过原位荧光杂交发现Skp2基因定位于人染色体5p13，该位点与染色体组型的改变有关。

Skp2蛋白包含一个近40个氨基酸组成的F-box结构域、10个富含亮氨酸重复区及Linker序列组成，其中F-box结构域属于与Skp1相结合的结构域，而富含亮氨酸重复区属于泛素化底物识别结构域。哺乳动物Skp2的富含亮氨酸重复区具有与酵母Grr1结构的相似性，可结合Cyclin E的自由形式[3]。Ji等[4]鉴定发现Skp2包括一个可与Cyclin A结合的结构域。

2 Skp2的功能

SCF（Skp1-Cul1-F-box protein）复合物作为一个E3连接酶，由不变的Skp1等元件和可变元件F-box蛋白组成。一方面，可变F-box蛋白可借其F-box结构域结合Skp1，另一方面，负责对底物的识别[5-7]。Skp2组成SCFSkp2复合物的重要成分并起识别底物蛋白的作用。从SCFSkp2的整体结构来看：Cul1-Rbx1-Skp1-F-boxSkp2复合物有一个高度延伸的结构，其中Rbx1和Skp1-F-boxSkp2分布于其相反的两端。Cul1作为复合物中的支架，与其他3个亚单位相互作用。Cul1由415个氨基酸形成的结合Skp1-F-boxSkp2复合物的N端螺旋状结构域和360个氨基酸形成的结合Rbx1的C端球形结构域组成[8]。

2.1 Skp2 与细胞周期调控的关系

SCF复合物可以介导涉及细胞周期过程、信号转导和转录目标蛋白的遍在蛋白化和随后的蛋白酶体降解，尤其是识别磷酸化的CDKN1B/p27kip及与G1/S期转换的调节有关。作为SCFSkp2复合物的底物识别亚单位，一系列生物化学和遗传研究证据显示细胞周期的多个阶段需要Skp2，包括G1/S转换期、S期、S/G2转换期[9-11]。Skp2敲除鼠显示细胞的缺陷，包括细胞核增大、中心体重叠和多倍性[3]。在细胞分裂周期阶段，Skp2作用的一个重要底物是p27kip1，这是一个CDK2和CDK1活动的抑制因子，通过降解p27kip1可以促进细胞进入DNA合成期和分裂期[3，11-14]。后来，又有几种细胞周期调节蛋白包括Myc[15-18]、Cyclin E[19]、p57kip2[20]、p21WAP1[21]、p130[22，23]、Cdt1[24]、hOrc1p[25]和E2F1[26]相继被报道属于Skp2介导的降解蛋白。

像许多细胞分裂周期调节因子一样，Skp2基因在细胞周期中呈现周期性表达[1，27]。Skp2在静止细胞和周期性细胞的早中G1期表达最低，当细胞接近G1/S转换期表达水平开始增加，在S期升至高水平，进入G2和M期开始降低。尽管蛋白表达水平并不完全依赖于细胞内的mRNA总量，但整个细胞分裂周期的Skp2 mRNA和蛋白水平被相似地调节[27-31]。细胞中Skp2蛋白的整体水平主要由Skp2降解率的变化所决定[27-29]，2003年Imaki等[32]证实GA结合蛋白与鼠Skp2基因的启动子活性调节有关。

由于Skp2决定大量关键细胞周期调节蛋白的降解，反常的Skp2表达在癌症发生中扮演着积极作用。在变异原始啮齿成纤维细胞和诱导裸鼠肿瘤的形成过程中，因Skp2与原癌基因H-Ras协作而表现致癌潜能[33]。Skp2的异位表达阻止细胞的分化[34，35]，在广泛的人肿瘤中被诱导表达中，Skp2 mRNA和蛋白直接与恶性肿瘤的级别相关[36-38]。Zhang等[39]分离和鉴定了人Skp2的启动子序列，并鉴定hSRE2对调节人正常与变异细胞Skp2启动子的活性具有重要作用。

Skp2进入细胞促进自由Cyclin E的遍在蛋白化和降解作用。Cyclin E与CDK2的联系阻止Skp2的结合，导致Cyclin E的稳定，Cyclin E与Skp2的结合看似不依赖于Cyclin E的磷酸化状态[3]。相反，CKI与Skp2的相互作用需要Cyclin E-CDK2复合物对p27Kip1的Thr-187的磷酸化[12，14]。在细胞周期中p27Kip1的降解开始于G1期后期，而出现在大多数Cyclin E处于S期的降解之前。由于CKI的降解，来自p27Kip1的Skp2可以捕捉被释放的Cyclin E，导致S期Cyclin E的减少。此外， 在S/G2期Skp2的充分增多可能加速Cyclin E的降解，提示Skp2管理出现在G1/S转换期的细胞周期调节因子降解的复杂模式[40]。

如果说蛋白互作常意喻蛋白的一些功能，Skp2与Cyclin A的互作也就是Skp2功能的一个重要方面。Skp2常在癌细胞中具有过表达现象，而Cyclin A在细胞增殖和生存中扮演着重要作用，Skp2可能通过这种互作影响Cyclin A的功能。通过这种Skp2与Cyclin A竞争性结合，可直接保护p27对Cyclin A的抑制[4]。

研究结果提示SCFSkp2是决定细胞G1/S转换期间细胞周期调节蛋白丰度的主要泛素连接酶。通过创建缺失Skp2老鼠的研究发现这种鼠产生细胞p27Kip1的积蓄、个体与器官尺寸减小及多倍性等特征[3]。Skp2的表达与p27Kip1的表达呈负相关并限定人类肉瘤和其他癌症的S期细胞[33，37，41-44]，转Skp2基因鼠的T淋巴细胞系增加发育成淋巴瘤的敏感性[37]。Skp2表达的紊乱可能导致癌症发生，尽管SCFSkp2 3个不变元件Skp1、Cul1和Rbx1的丰度在细胞周期确实没有变化，但Skp2的总量却依赖细胞周期而变化。Skp2首先在G1/S过渡期可以检测出来，在S/G2期开始蓄积，并当细胞进行到M期开始减少，其转录或转录后的调节被认为是这些变化的基础。Skp2 mRNA在HeLa和NIH3T3细胞内具有周期性特点，而Skp2的浓度主要由泛素介导的蛋白降解进行调节[27]。

2.2 Skp2的其他功能

最近的研究表明Skp2可能在机体中涉及一些新的功能。一些肥胖症的病因学也许与脂肪细胞超常增生有关。周期素依赖性蛋白激酶抑制因子p27调节负责细胞分裂周期进程周期素依赖性蛋白激酶复合物的活性，这个蛋白对成人脂肪细胞数量具有关键作用，p27的敲除增加了脂肪细胞的数量。而SCF复合物以p27一类蛋白作为泛素蛋白酶体降解的靶蛋白，其中的识别元件Skp2特异性识别p27。敲除Skp2基因鼠的研究发现其皮下和内脏脂肪块和脂肪细胞数目减少了50%，已经超过了其体重、肾或肌肉的减少总量。而进一步的p27与Skp2双重敲除试验结果发现前者与后者的脂肪减少量是相反的，表明Skp2调节脂肪的形成和脂肪数量，可能促成脂肪细胞超常增生肥胖症的产生[45]。

Wu等[46]研究了Skp2调节血管平滑肌增殖和新生内膜形成的作用，第一次通过运用鼠的动脉损伤模型发现Skp2在此进程中具有重要作用。血管平滑肌增殖是血管成形术后或支架术后再狭窄、静脉移植衰竭和移植动脉硬化发展的基础，此研究首次证明Skp2是适应血管损伤后的血管平滑肌增殖和新生内膜增厚的主要调节因子，强调Skp2作为未来策略方向克服血管增生性疾病的一个潜在目标。

Boix-Perales等[47]运用非洲蟾蜍作为模式系统，证明Skp2可调节初级神经元的分化，非洲蟾蜍Skp2在早期胚性神经组织显示出动态表达谱，Skp2的缺失导致额外的初级神经元增殖。相反，通过充当SCFSkp2复合物的组分形式，Skp2过表达则抑制神经的发生。周期依赖性蛋白激酶抑制因子Xic1是初级神经发生早期所必需的因子，显示在胚胎期SCFSkp2复合物降解此抑制因子，这种作用致使Skp2具有调节神经的能力。

3 Skp2与人类肿瘤的关系

至今，人类肿瘤的病因和致病机理还未完全明确，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡调节基因或DNA修复基因的改变等。但肿瘤发生具有一个明显的共同特征：细胞周期调控机制紊乱，导致细胞生长失控。近些年的许多研究证明癌基因Skp2与肿瘤的发生和发展有着密切的关系[48，49]。

Gstaiger等[50]通过免疫组织化学技术对正常口腔上皮细胞和恶性口腔癌进程的几个发育阶段进行了Skp2和p27蛋白表达检测。发现一部分口腔上皮发育异常和癌症与正常上皮细胞对照组存在升高的Skp2蛋白水平与p27下降有关联。Skp2可能促成恶性表型，Skp2蛋白过表达导致p27蛋白水解作用的加速及从发育异常至口腔上皮癌症的恶性演化。Skp2在口腔上皮癌症过程中水平上调，具有致癌潜能。在对75例唾液腺癌症患者Skp2的表达测定结果发现，53%的病例Skp2的表达小于或等于4%，而47%的病例大于4%。从染色等级来看，Skp2的上升与p27的下降存在显著相关性，增高的Skp2与上升的TUNEL也具有显著相关性。当Skp2表达增高时，存活概率则降低[51]。Forkhead转录因子通过诱导生长抑制和编程性细胞死亡在肿瘤抑制中扮演中枢作用，由于磷酸化和蛋白酶体的降解致使这些因子功能丧失被认为与细胞的转化和恶性肿瘤有关。Huang等[52]研究证明Skp2促进了FOXO1的降解，Skp2的表达抑制FOXO1的转活和消除了FOXO1对细胞增殖与生存的抑制效果。在鼠淋巴瘤模型中当Skp2过表达时，FOXO1蛋白已经消失，这也表明Skp2通过促进FOXO1的蛋白水解作用而在肿瘤发生中起着重要作用。Latres等[53]研究证明Skp2作为原癌基因与淋巴瘤的发病机理有关。Skp2常在人类癌症中过表达并与预后不良相关联。Skp2除了诱导p27的降解和增强细胞的增生外，还具有促进肿瘤发生的作用。Hung等[54]通过建立过表达Skp2的转染子展示出增强的肿瘤细胞浸润和转移能力，另外发现上调金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的表达，提出这种上调表达是Skp2促进细胞浸润的一种机制，抑制Skp2的表达也许可以抑制肿瘤的浸润和转移。

目前大量的人类疾病研究证明Skp2在多种癌症细胞中过表达，与部分肿瘤细胞的增殖和预后密切相关，可见对肿瘤的发生与发展具有重要的作用。Skp2也因其具有致癌活性而被称为癌基因和癌蛋白，已成为研究人类肿瘤的热点基因。随着Skp2的进一步深入研究，其在细胞周期调控中的作用及致癌机制将得到更深层次的阐明，从而为肿瘤的发病机理、预防和诊治等提供新的理论依据和新的途经[48]。

4 Skp2的转录调控

Skp2 mRNA和蛋白含量随细胞周期性而调节变化，在G1/S转换期和S早期具有最高的表达水平，这种调节出现在转录和转录后的水平调节，Skp2基因在许多变异人细胞和初期肿瘤中具有高表达水平。Zhang等[39]通过Skp2过表达的机理研究发现Skp2基因包含一个功能性的E2F反应元件，E2F1的异位表达诱导人成纤维细胞内源性Skp2基因表达，而对人肿瘤细胞系进行E2F1敲除则减少了内源性Skp2基因表达。通过E2F1 AS-ODN的转染，E2F1水平降低，Skp2 mRNA和蛋白水平也随之降低；相反对照组却没有影响Skp2 mRNA和蛋白的表达，因此内源性E2F1的活性是人肿瘤细胞Skp2高水平表达所必需的元件。

Skp2 mRNA的丰度依据细胞分裂周期的形式而波动，在Skp2转录调节研究中，位点突变作用揭示其核心结合基序CACTTCCG与GA-结合蛋白（GABP）的基序相似，且为Skp2转录所必需。GABP的过表达增加了Skp2启动子的活性，GABP的抑制则导致了Skp2启动子活性的减弱，说明GABP对Skp2表达和调节G1/S细胞周期的转换具有重要作用[32]。

5 Skp2的启动子

Imaki等[32]分离了鼠Skp2基因的5′端非翻译区序列，并鉴定了基因的转录起始位点。尽管类似TATA盒子的序列没有出现在转录起始区域，但3个GC盒子（Sp1结合位点）存在起始位点的上游区中，另外发现GABP、Taf-1和PacC的潜在结合位点分别位于-166～-159、-10～-1及-188～-172区域。荧光素酶活性检测等分析表明位于-207～-103间的顺式元件是Skp2的转录调节所必需的序列。为评定与Skp2转录调节有关的因子和机制，Zhang等[39]分离了人Skp2基因的4 237 bp的序列，以人Skp2基因的ATG翻译起始位点上游邻近的500 bp的启动子序列与鼠相对应的序列相比较发现具有67%的序列相似性。其转录起始位点位于翻译起始位点上游的186 bp处，并不包含TATAA和CCAAT盒子序列。通过与转录因子结合位点数据库的比较分析，鉴定了几个潜在的调节元件，包括转录因子结合位点c-Rel/NF-kap、AP1、SRY、Sp1、GATA和E2F（图1），研究证明+65～+149的区域对高水平Skp2启动子功能至关重要。

6 展望

从以上研究结果可以看出，Skp2在细胞周期调控过程中通过降解大量关键细胞周期调节蛋白而体现其功能，在机体正常发育和疾病状态下，均可通过细胞增殖或凋亡的方式表现出来，肿瘤的发展、细胞的增殖及细胞凋亡与其表达水平的高低存在密切的关联，但其分子作用机理却有待于更深入地研究。同时，这些Skp2的相关研究进展引发了关于畜禽科学与医学两个方面的设想：①在畜牧业生产方面，人们总是希望通过提高畜禽的生产性能来获得更好的养殖效益。为获得更佳的生产性能，目前从畜禽的品种、营养、饲养环境、遗传育种等各方面进行了较多的研发以及与生产性状关联的基因筛选的研究，这些研究为畜牧业带来了显著的经济效益。Skp2是否也能通过调控细胞增殖与畜禽生产性能存在关联将有待于进一步研究。②在动物医学方面，不同器官的组织与细胞结构往往有着较大的差异，而这些不同比例的组织结构直接决定器官的功能与特征。如果能探明Skp2在组织结构发育过程中的表达规律及其对细胞增殖与凋亡的调控机制，或可以利用基因或蛋白等现代生物技术来调控器官的组织分化程度，势必对改善动物的免疫机能和器官功能产生重大影响与深远意义。

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